Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши
Summary
Здесь мы представляем Роман микрохирургическая техника для изоляции нервных стволовых клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E.
Abstract
Нервные стволовые клетки (NSCs) Multipotent с и может привести к трем видам основных клеток центральной нервной системы (ЦНС). В vitro культуры и расширение NSCs обеспечивают удобный источник клеток для неврологов для изучения функции нейронов и глиальных клеток, а также их взаимодействия. Существует несколько методов сообщил для изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона млекопитающих мозги. Во время микрохирургической операции изолировать NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС очень важно уменьшить повреждение клетки мозга, чтобы получить самый высокий коэффициент живой и расширяемая стволовых клеток. Возможный способ для снижения стресса во время изоляции этих клеток мозга эмбриона мыши — сокращение времени хирургического. Здесь мы демонстрируем разработанная методика для быстрой изоляции этих клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E. Хирургические процедуры включают в себя сбор эмбрионов мыши13 E от матки, резка лобной Фонтанелле эмбриона с изогнутой иглой оконечности, извлечение мозг от черепа, microdissection изолированных мозга урожай Ганглиозный возвышение, диссоциация заготовленной ткани в НСК среднего получить одну ячейку подвеска, и, наконец, обшивка клеток в культуре подвеска для создания neurospheres.
Introduction
Нервные стволовые клетки (NSCs) находятся в различных регионах мозга взрослого и эмбрион, и они имеют тенденцию генерировать различные типы нейронов и глиальных клеток1. НБК богатые регионы3субвентрикулярной зоны в взрослого мозга млекопитающих2 и Ганглиозный возвышением головного мозга эмбриона. В развивающемся мозге Ганглиозный возвышение обеспечивает большую часть коры интернейронов и особенно ГАМК интернейронов3. Есть также менее инвазивные методы для генерации нервных стволовых клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или использовать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), которые снижают спрос на животных. Несмотря на то, что создание NSCs из ЭСК или iPSCs возможно4,5она имеет некоторые преимущества и недостатки по сравнению с изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона мозга6,7, 8. Протоколы для стимулирования дифференцирования ЭСК и iPSCs сторону нейрональных фенотипов всегда времени и стоимости потребления и уровень успеха (70-80% Nestin положительные клетки)5 ниже по сравнению с прямым изоляции NSCs от животных мозга ( более 99% Nestin позитивных клеток)9. Кроме того стволовые клетки теряют их генетической стабильности и дифференциации тенденция после нескольких проходов10,11. Даже несмотря на то, что есть другие новые сообщения о прямое преобразование соматических клеток в NSCs, эти клетки генетически модифицированные и не являются легко доступны в каждой лаборатории12. Таким образом существует большой спрос на изоляции нервных стволовых клеток от животных мозга; Это позволяет уменьшить количество животных использования путем совершенствования хирургической техники. Путем сокращения времени, хирургические и улучшения методов, можно сохранить клетки от повреждения и получить высокий уровень NSCs от каждого животного.
Здесь мы представляем упрощенной и воспроизводимый метод для изоляции нервных стволовых клеток от мозга эмбриона мыши E13 .
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью подходящего источника нервных стволовых клеток является очень важным для неврологов. Нервные стволовые клетки могут быть собраны из различных областей мозга эмбриона и они могут генерировать конкретные типы нейронов и глиальных клеток. Существует несколько методов для инд?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана института Руана.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
