Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales
Summary
Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.
Abstract
Les cellules souches neurales (CNS) sont multipotentes et peut donner lieu à trois types cellulaires majeurs du système nerveux central (CNS). La culture in vitro et l’expansion des CNS fournissent une source appropriée de cellules pour les chercheurs en neurosciences étudier la fonction des neurones et des cellules gliales ainsi que leurs interactions. Il existe plusieurs techniques signalés pour isoler des cellules souches neurales du cerveau mammifère adulte ou embryonnaire. Pendant l’opération microchirurgie pour isoler des CNS de différentes régions du SNC embryonnaire, il est très important réduire les dommages au cerveau des cellules pour obtenir le taux élevé de cellules souches vivantes et extensibles. Une technique possible pour la réduction du stress au cours de l’isolement de ces cellules du cerveau d’embryon de souris est la réduction du temps chirurgical. Ici, nous démontrons une technique mise au point pour l’isolement rapide de ces cellules de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire. Procédures chirurgicales incluent récolte d’embryons de souris13 E de l’utérus, coupant la fontanelle frontale de l’embryon avec une pointe d’aiguille tordue, extraire le cerveau du crâne, microdissection du cerveau isolé de récolter l’éminence ganglionnaire, dissociation du tissu récolté dans le milieu du NSC pour obtenir une suspension de cellules du même et enfin électrodéposition de cellules en suspension pour générer des neurospheres.
Introduction
Des cellules souches neurales (CNS) résident dans différentes régions du cerveau adulte et de l’embryon, et ils ont tendance à générer différents types de neurones et cellules gliales1. Les zones sous-ventriculaire dans le cerveau des mammifères adultes2 et éminence ganglionnaire dans le cerveau de l’embryon sont NSC riches régions3. Dans le développement du cerveau, l’éminence ganglionnaire fournit la plupart des interneurones corticaux et particulièrement GABAergique interneurones3. Il y a aussi des méthodes moins invasives pour la production de cellules souches neurales de cellules souches embryonnaires (CSE) ou utiliser des cellules souches pluripotentes induites (CISP) qui réduisent la demande de l’animal. Malgré le fait que générer des CNS d’ESCs ou CISP est possible4,5, il a ses avantages et inconvénients par rapport à l’isolement des cellules souches neurales de l’adulte ou l’embryon cerveau6,7, 8. Les protocoles pour induire la différenciation des ces et CISP vers phénotypes neurones sont toujours temps et coût de consommation et le taux de succès (70-80 % Nestin cellules positives)5 est plus faible comparativement à isolement direct des CNS le cerveau animal ( plus de 99 % Nestin cellules positives)9. En outre, les cellules souches perdent leur tendance de stabilité et de la différenciation génétique après plusieurs passages10,11. Même s’il existe d’autres nouveaux rapports sur la conversion directe de cellules somatiques en CNS, ces cellules sont génétiquement modifiées et ne sont pas facilement accessibles dans chaque laboratoire12. Par conséquent, il y a toujours une grande demande pour isoler des cellules souches neurales dans le cerveau de l’animal ; Il est possible de réduire la quantité d’utilisation de l’animale en améliorant les techniques chirurgicales. En réduisant le temps chirurgical et en améliorant les techniques, il est possible de garder les cellules des dommages et d’obtenir le taux le plus élevé des CNS de chaque animal.
Ici, nous présentons une technique simplifiée et reproductible pour l’isolement de cellules souches neuronales du cerveau de souris E13 embryons.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’aide d’une source de cellules souches neuronales est très important pour les chercheurs en neurosciences. Des cellules souches neurales pourraient être récoltés de différentes zones du cerveau de l’embryon et qu’ils peuvent générer des types spécifiques de neurones et les cellules gliales. Il existe plusieurs méthodes pour l’induction de la différenciation des cellules souches neurales de les amener à générer des neurones matures et les cellules gliales. Il y a de nombreux rapports indiquant q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Institut de Royan.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
