Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen
Summary
Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.
Abstract
Neurale stamcellen (NSCs) zijn multipotente en aanleiding kunnen geven tot de drie grote celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS). In vitro cultuur en uitbreiding van de NSCs zorgen voor een geschikte bron van cellen voor neurowetenschappers te bestuderen van de functie van neuronen en gliale cellen samen met hun interacties. Er zijn verschillende gerapporteerde technieken voor de isolatie van neurale stamcellen uit volwassen of embryonale zoogdieren hersenen. Tijdens de microchirurgische operatie te isoleren NSCs uit verschillende regio’s van de embryonale CNS, is het zeer belangrijk ter beperking van de schade aan de hersencellen te verkrijgen van de hoogste verhouding van live en uitbreidbaar stamcellen. Een mogelijke techniek voor spanningsvermindering tijdens isolatie van deze cellen uit de hersenen van muis embryonale is de vermindering van de chirurgische tijd. Hier tonen wij een ontwikkelde techniek voor snelle isolatie van deze cellen van de E13 muis embryo ganglionaire eminentie. Chirurgische procedures omvatten E13 muis embryo’s uit de baarmoeder, snijden de frontale fontanelle van het embryo met een gebogen naald tip, het uitpakken van de hersenen van de schedel, de microdissection van de geïsoleerde hersenen om te oogsten van de ganglionaire eminentie, oogsten dissociatie van het geoogste weefsel op NSC middellange tot het krijgen van een enkele celsuspensie, en ten slotte plating cellen in schorsing cultuur voor het genereren van neurospheres.
Introduction
Neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in verschillende regio’s van de volwassene en embryo hersenen en ze hebben de neiging om het genereren van verschillende soorten neuronen en gliale cel1. De subventriculaire zones in de volwassen zoogdieren hersenen2 en ganglionaire eminentie in de hersenen embryo zijn NSC rijke regio’s3. In de ontwikkelende hersenen levert de ganglionaire eminentie allermeest naar de corticale interneuronen en met name GABAergic interneuronen3. Er zijn ook minder invasieve methoden voor neurale stamcellen generatie vanaf embryonale stamcellen (SER’s) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) die het verminderen van de vraag naar dier gebruiken. Ondanks het feit dat het genereren van NSCs van sociaal-economische raden of iPSCs mogelijk4,5 is, heeft het een aantal voordelen en nadelen vergeleken met het isolement van neurale stamcellen uit de volwassen of embryonale hersenen6,7, 8. De protocollen voor de differentiatie van SER’s en iPSCs richting neuronale fenotypen inducerende zijn altijd tijd en kosten consumeren en het tarief van succes (70-80% Nestin positieve cellen)5 is lager in vergelijking met de directe isolatie van NSCs uit de dierlijke hersenen ( meer dan 99% Nestin positieve cellen)9. Bovendien verliezen stamcellen hun genetische stabiliteit en differentiatie neiging na verscheidene passages10,11. Hoewel er andere nieuwe rapporten over directe omzetting van somatische cellen in NSCs, deze cellen zijn genetisch gemanipuleerde en zijn niet gemakkelijk toegankelijk in elk lab12. Daarom, is er nog steeds een grote vraag voor isolatie van neurale stamcellen van de dierlijke hersenen; het is mogelijk om het verminderen van de hoeveelheid dierlijke gebruik door het verbeteren van de chirurgische technieken. Door verkorting van de chirurgische en verbetering van de technieken, is het mogelijk om te houden van de cellen uit de buurt van schade en het hoogste percentage van NSCs te verkrijgen van elk dier.
Hier introduceren we een vereenvoudigde en reproduceerbare techniek voor isolatie van neurale stamcellen van muis E13 embryo hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van een geschikte bron van neurale stamcellen is zeer belangrijk voor neurowetenschappers. Neurale stamcellen kan worden geoogst uit verschillende gebieden van de hersenen van embryo en ze kunnen het genereren van specifieke soorten zenuwcellen en gliacellen. Er zijn verschillende methoden voor de inductie van differentiatie van neurale stamcellen voor het opwekken van hen voor het genereren van volwassen zenuwcellen en gliacellen. Er zijn talrijke rapporten die aangeeft dat zij onder de voorwaarden van de spe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Instituut van Royan.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
