Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion
Summary
Strukturellt relaterade proteiner utöva ofta olika biologiska funktioner. Utbyte av motsvarande regioner i dessa proteiner för att skapa chimära proteiner utgör en innovativ metod för att identifiera kritiska protein regioner som ansvarar för deras funktionella skillnader.
Abstract
Målet med detta protokoll omfattar utformningen av chimära proteiner där distinkta regioner av ett protein ersättas med deras motsvarande sekvenser i ett strukturellt likartade protein, för att fastställa funktionella betydelsen av dessa regioner. Sådan chimärer genereras genom ett nästlade PCR-protokoll med hjälp av överlappande DNA-fragment och adekvat primers, följt av deras uttryck inom ett däggdjur system för att säkerställa infödda sekundärt strukturera och post-translationella modifieringar.
Den funktionella rollen för en distinkt region framgår sedan av en förlust av aktivitet av chimera i ett lämpligt avläsning test. Följaktligen identifieras regioner härbärgerat en uppsättning kritiska aminosyror, vilket ytterligare kan kontrolleras med kompletterande tekniker (t.ex. webbplats riktad mutagenes) för att öka molekylär upplösning. Begränsad till fall där ett strukturellt relaterade protein med olika funktioner kan hittas, men chimära proteiner har lyckat använts att identifiera kritiska bindande regioner i proteiner såsom cytokiner och cytokin receptorer. Denna metod är särskilt lämplig i fall där proteinets funktionella regioner inte är väldefinierade och utgör ett värdefullt första steg i riktad evolution metoder att begränsa Regionkommittén sevärdheter och minska den screening ansträngningen inblandade.
Introduction
Flera typer av proteiner, inklusive cytokiner och tillväxtfaktorer, grupperas i familjer vars medlemmar delar liknande tredimensionella strukturer men ofta utöva olika biologiska funktioner1,2. Denna funktionella mångfald är oftast en följd av små skillnader i aminosyra sammansättning inom molekylens aktiva platser3. Identifiering av sådana platser och funktionella bestämningsfaktorer inte bara erbjuder evolutionära insikter utan också att utforma mer specifika agonister och hämmare4. Det stora antalet skillnader i rester sammansättning ofta hittas mellan strukturellt relaterade proteiner komplicerar dock denna uppgift. Även om att konstruera stora bibliotek som innehåller hundratals mutanter är numera möjligt, bedöma varje enskild rester variation och kombinationer av dem fortfarande är en utmanande och tidskrävande insats5.
Tekniker att bedöma funktionella betydelsen av stora protein regioner är således av värde för att minska antalet möjliga rester till en hanterbar nummer6. Trunkerade proteiner har varit den mest använda metoden att tackla denna fråga. Följaktligen är regioner anses vara funktionellt relevanta om funktionen protein under studien påverkas av strykningen av en viss region7,8,9. En stor begränsning med denna metod är dock att strykningar kan påverka proteinets sekundärt strukturera, leder till Skellefteåsjukan, aggregering och oförmågan att studera avsedda regionen. Ett bra exempel är en stympad version av cytokin oncostatin M (OSM), som studerat en inre radering som är större än 7 rester resulterade i en felveckning mutant som inte kunde ytterligare10.
Generering av chimära proteiner utgör ett alternativ och innovativa förhållningssätt som tillåter analys av större protein regioner. Målet med denna metod är att utbyta regioner av intresse i ett protein av strukturellt relaterade sekvenser i ett annat protein, för att kunna bedöma bidraget från de utbytta delarna till specifika biologiska funktioner. Ofta används i fältet för signalering receptorer att identifiera funktionella domäner11,12, är chimär proteiner särskilt användbart för att studera protein familjer med lite aminosyra identitet men bevarade sekundärt strukturera. Lämpliga exempel kan hittas i klassen av interleukin-6 (IL-6) typ cytokiner, såsom interleukin-6 och ciliär neurotrofisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hämmande faktor (LIF) och OSM (20% identitet)6, där den följande protokoll är baserad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av chimära proteiner utgör en mångsidig teknik, vilket kan gå bortom gränserna för trunkerade proteiner att hantera frågor såsom Modulariteten av cytokin-receptor bindande domäner13. Utformningen av chimärer är ett viktigt steg i denna typ av studier och kräver noggrant övervägande. Preliminära studier för att fastställa funktionella domäner kräver generellt substitution av breda regioner i en första fas, medan mindre ersättare av variabla längder är mer lämpade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet och Schüchtermann-kliniken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB öglan och D-helix i bindningsställe III av mänskliga Oncostatin M (OSM) krävs för OSM receptor aktiveringen. J. Biol. Chem. 2018. 18:7017-7029. © författarna.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
