Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw
Summary
Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio’s die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.
Abstract
Het doel van dit protocol omvat het ontwerp van chimeer eiwitten waarin verschillende regio’s van een eiwit worden vervangen door hun overeenkomstige sequenties in een structureel vergelijkbaar eiwit, om te bepalen van het functionele belang van deze regio’s. Dergelijke Chimaera worden gegenereerd door middel van een geneste PCR protocol met overlappende DNA-fragmenten en adequaat ontworpen primers, gevolgd door hun expressie binnen een zoogdieren systeem om inheemse secundaire structuur en posttranslationele modificaties.
De functionele rol van een afzonderlijke regio wordt vervolgens aangegeven door een verlies van activiteit van de Chimaera in een passende uitlezing assay. Als gevolg hiervan worden regio’s herbergen een aantal essentiële aminozuren geïdentificeerd, die verder kan worden gescreend door complementaire technieken (bijvoorbeeld plaats-geleide mutagenese) te verhogen van de moleculaire resolutie. Hoewel beperkt tot gevallen waarin een structureel verwante proteïne met verschillende functies kan worden gevonden, hebben chimeer eiwitten met succes gewerkt aan het identificeren van de kritische bindende regio’s in de proteïnen zoals cytokines en cytokine receptoren. Deze methode is met name geschikt in gevallen waarin de proteïne van functionele regio’s niet goed gedefinieerd, en vormt een waardevolle eerste stap in gerichte evolutie benaderingen te beperken van de regio’s van belang en de betrokken controle-inspanning te verminderen.
Introduction
Verschillende soorten eiwitten, met inbegrip van cytokines en groeifactoren, gegroepeerd in gezinnen waarvan de leden delen van soortgelijke driedimensionale structuren maar vaak oefenen verschillende biologische functies1,2. Deze functionele diversiteit is meestal het gevolg van kleine verschillen in aminozuursamenstelling binnen3actieve sites van het molecuul. Identificatie van dergelijke sites en functionele determinanten alleen bieden geen waardevolle evolutionaire inzichten maar ook ontwerpen van meer specifieke agonisten en remmers4. Echter compliceert het grote aantal verschillen in de samenstelling van de residuen vaak gevonden tussen structureel verwante proteïnen deze taak. Hoewel de bouw van grote bibliotheken met honderden mutanten is tegenwoordig haalbaar, beoordeling van elke één residu variatie en combinaties van hen blijft een uitdagende en tijdrovende inspanning5.
Technieken beoordelen het functionele belang van grote eiwit regio’s zijn dus van waarde om het aantal mogelijke residuen tot een beheersbaar nummer6. Afgeknotte proteïnen zijn de meest gebruikte aanpak van dit probleem. Dienovereenkomstig, regio’s worden beschouwd als functioneel relevant als de eiwitfunctie bestudeerde wordt beïnvloed door de verwijdering van een bepaalde regio7,8,9. Een belangrijke beperking van deze methode is echter dat de verwijderingen van het eiwit secundaire structuur, wat leidt tot misfolding, samenvoeging en het onvermogen om te bestuderen van de beoogde regio kunnen beïnvloeden. Een goed voorbeeld is een afgeknotte versie van de cytokine-oncostatin M (OSM), waarin een interne schrapping groter dan 7 residuen resulteerde in een misfolded mutant die niet verder kan worden bestudeerd10.
De generatie van chimeer eiwitten vormt een alternatieve en innovatieve aanpak waarmee de analyse van de regio’s groter eiwit. Het doel van deze methode is om te wisselen van regio’s van belang in een eiwit door structureel verwante sequenties in een ander eiwit, teneinde de bijdrage van de vervangen onderdelen aan specifieke biologische functies. Op grote schaal gebruikt op het gebied van signalering van receptoren te identificeren van functionele domeinen11,12, zijn chimeer eiwitten met name nuttig zijn te onderzoeken eiwit gezinnen met weinig aminozuur identiteit maar geconserveerde secundaire structuur. Passende voorbeelden kunnen worden gevonden in de klasse van Interleukine-6 (IL-6) type cytokines, zoals Interleukine-6 en Ciliaire neurotrophic factor (6% reeks identiteit)13 of leukemie remmende factor (LIF) en OSM (20% identiteit)6, waarop de volgens protocol is gebaseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De generatie van chimeer eiwitten vormt een veelzijdige techniek, die in staat zijn verder te gaan dan de grenzen van afgeknotte eiwitten om vragen te stellen zoals de modulariteit van cytokine-receptor bindende domeinen13is. Het ontwerp van Chimaera is een belangrijke stap in dit soort studies, en vereist zorgvuldige afweging. Voorbereidende studies om functionele domeinen vergt over het algemeen substitutie van brede regio’s in een eerste fase, terwijl kleinere vervangingen van variabele lengtes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft en de Schüchtermann-kliniek (Bad Rothenfelde, Duitsland). Onderdeel van dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het dagboek van biologische chemie. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. De lus van de AB en D-helix in de bindende site III van menselijke Oncostatin M (OSM) zijn vereist voor OSM receptor activering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © de auteurs.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
