זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה
Summary
חלבונים הקשורים מבחינה מבנית להפעיל לעתים קרובות תפקודים ביולוגיים ברורים. ההחלפה של אזורים המקבילה של חלבונים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric מהווה גישה חדשנית כדי לזהות אזורים קריטיים חלבון אשר אחראים על הבדלי הפונקציונלית שלהם.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה מקיף את העיצוב של חלבונים chimeric שבו אזורים הנבדלים זה מזה של חלבון מוחלפים על-ידי שלהם רצפי המתאימים חלבון מבנית דומה, על מנת לקבוע את החשיבות פונקציונלי של אזורים אלה. כזה כימרות נוצרות באמצעות פרוטוקול ה-PCR מקוננות באמצעות קטעים חופפים DNA ועוצב שלמאחה תחל, ואחריו הביטוי שלהם בתוך מערכת יונקים כדי להבטיח מבנה שניוני יליד ושינויים post-translational.
תפקיד פונקציונלי של אזור ברורים אז מציינים לאובדן של הפעילות של החימרה ב וזמינותו הבדיקה המתאימה. כתוצאה מכך, אזורי מחסה ערכה של חומצות אמינו קריטי מזוהים, אשר יכולים להיות מוקרן נוספת בטכניקות משלימים (למשל מוטגנזה) כדי להגדיל את הרזולוציה מולקולרית. למרות מוגבל למקרים שבהם ניתן למצוא חלבון מבנית קשורים עם פונקציות שונות, חלבונים chimeric יש כבר בהצלחה מועסקים כדי לזהות אזורים איגוד קריטי ב חלבונים כגון קולטנים ציטוקינים ו ציטוקינים. שיטה זו מתאימה במיוחד במקרים שבהם אזורים פונקציונליים של החלבון אינם מוגדרים היטב, ומהווה צעד ראשון חשוב בגישות אבולוציה מכוונת לצמצם את האזורים של ריבית, להפחית את המאמץ ההקרנה מעורב.
Introduction
מספר סוגים של חלבונים, לרבות ציטוקינים גורמי גדילה, מקובצים במשפחות שחבריה חולקים מבנים תלת מימדיים דומה אך לעיתים קרובות להפעיל פונקציות ביולוגיות שונות1,2. המגוון פונקציונלי הוא בדרך כלל התוצאה של הרכב חומצות אמינו בתוך אתרים פעילים של המולקולה3הבדלים קטנים. זיהוי של אתרים כאלה גורמים תפקודית לא רק להציע תובנות אבולוציונית אלא גם עיצוב ספציפי יותר אגוניסטים, מעכבי4. עם זאת, מספר גדול של ההבדלים בהרכב שאריות לעתים קרובות למצוא בין חלבונים הקשורים מבחינה מבנית מסבך משימה זו. אף-על-פי בניית ספריות גדול המכיל מאות מוטציות כיום ריאלי, הערכת כל וריאציה שאריות יחיד ונותרה שילובים שלהם עדיין מאתגר ולגזול מאמץ5.
טכניקות להעריך את חשיבות תפקודית של חלבון גדולה אזורים ובכך הם בעלי ערך כדי לצמצם את מספר שאריות אפשרי לניהול מספר6. חלבונים קטום כבר הגישה הנפוצה ביותר כדי להתמודד עם בעיה זו. בהתאם לכך, אזורים נחשבים באופן פונקציונלי זה רלוונטי אם הפונקציה חלבון שנבחנה מושפע על-ידי המחיקה של אזור מסוים7,8,9. אולם, מגבלה עיקרית של שיטה זו הוא כי מחיקות יכול להשפיע על מבנה שניוני של החלבון, המוביל אל misfolding, צבירת וחוסר יכולת ללמוד את האזור המיועד. דוגמה טובה היא גרסה קטום של ציטוקינים oncostatin M (OSM), שבו למד מחיקה פנימיים גדולים יותר משקעים 7, גרמו מוטציה misfolded שלא היתה אפשרות נוספת10.
הדור של חלבונים chimeric מהווה גישה חלופית וחדשנית המאפשרת הניתוח של אזורים גדולים יותר חלבון. המטרה של שיטה זו היא להחליף מחוזות עניין חלבון מאת רצפים הקשורות מבנית בחלבון אחר, כדי להעריך את התרומה של הסעיפים הוחלף על תפקודים ביולוגיים ספציפיים. בשימוש נרחב בתחום של איתות קולטנים לזהות תחומים פונקציונליים11,12, חלבונים chimeric שימושיים בעיקר ללמוד חלבון משפחות עם מעט חומצת אמינו זהות אבל שנשמרת מבנה שניוני. ניתן למצוא דוגמאות המתאימות בכיתה של interleukin-6 (IL-6) מסוג ציטוקינים, כגון neurotrophic interleukin-6 ו ciliary פקטור (6% רצף זהות)13 או לוקמיה מעכבות פקטור (LIF) ו OSM (20% זהות)6, שבו ע פ הפרוטוקול מבוסס.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור של חלבונים chimeric מהווה טכניקה רב-תכליתי, אשר מסוגל ללכת מעבר לגבולות של חלבונים קטום להפנות שאלות כגון המודולריות של ציטוקינים-קולטן איגוד תחומים13. העיצוב של כימרות נמצא צעד מפתח בסוג זה של מחקרים, ודורש שיקול דעת זהיר. מחקרים ראשוניים להקים תחומים פונקציונליים בדרך כלל י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק ו- Schüchtermann-המרפאה (רע Rothenfelde, גרמניה). חלק מחקר זה פורסם לראשונה בכתב העת לכימיה ביולוגית. אדריאן-Segarra, מ’ ג’, שינדלר, ש, Gajawada, עמ’, Lörchner, ה’, בראון, טי & Pöling, ג’יי לולאה AB ו- D-סליל באתר איגוד השלישי של מ’ Oncostatin האנושית (OSM) נדרשים עבור הפעלת קולטן OSM. ג’יי Biol.. כימיה 2018; 18:7017-7029. © המחברים.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
