Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi
Summary
HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.
Abstract
HIV istikrarlı ve gizli virüs formu, bağışıklık sistemi için görünmez kalır ve geçerli antiretroviral tedavi (sepeti) tarafından hedeflenen değil, limanlar bir rezervuar hücrelerin varlığı nedeniyle çaresiz kalır. Transkripsiyon ve yapıştırma CD4 + T hücreleri dinlenme içinde HIV-1 gecikme güçlendirmek için gösterilmiştir. Gecikme süresi gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) “şok ve öldürmek” yaklaşımı kullanılarak iptali kapsamlı bir girişim bu rezervuar temizlemek için eğitim gördü ama şu ana kadar herhangi bir başarı yeterli küçük gelişim eksikliği nedeniyle klinik çalışmalarda gösterilmemiştir verimli bir şekilde bu rezervuar huzursuz molekülleri. Burada sunulan Protokolü güvenilir ve verimli bir şekilde gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) HIV transkripsiyon değerlendirilmesi ve yapıştırma için bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım aynı anda transkripsiyon ve yapıştırma bir LRA etkisi ölçebilen bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir kullanımı akış sitometresi tarafından temel alır. Burada açıklanan protokol yapışık hücreleri gibi süspansiyon hücrelerde için yeterlidir. Çok sayıda uyuşturucu yüksek üretilen iş sisteminde test etmek için kullanışlıdır. Teknik olarak uygulamak basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Buna ek olarak, akış sitometresi kullanımı hücre canlılığı değerlendirmesini sağlar ve böylece ilaç toksisitesi vasıl ayni zaman.
Introduction
Etkili uzun vadeli antiretroviral tedavi rağmen HIV bellekte CD4 + T hücreleri1tümleşik bir provirus olarak gizli bir durumda kalır. HIV-1 5 kromatin yapısı ‘ uzun terminal tekrar (LTR) organizatörü ve histon metilasyonu ve DNA methyltransferases (DNMT) ve histon uyku (HDAC) tarafından deasetilasyonu gibi epigenetik değişiklikleri önde gelen önemli mekanizmalar vardır Transkripsiyon baskı ve böylece sonrası entegrasyon gecikme süresi2,3. Gecikme süresi ters kayıt ajanlar (LRAs), büyük bir çeşitlilik virüs üretim tüp bebek ikna etmek onların etkinliği araştırıldı ve üzerinden vivo gizlice enfekte dinlenme CD4 + T hücreleri4,5,6,7 ,8. LRAs arasında test, HDACi (HDAC inhibitörleri) ve bahis bromodomain inhibitörleri (BETis) kromatin decondensation ve serbest bırakmak-in olumlu transkripsiyon uzama faktörü b (P-TEFb) sırasıyla neden, sonraki lider rahatlatmak transkripsiyon baskı, 5′ soldan sağa ve HIV ifade9,10,11,12,13aktivasyonu. Ancak, bu LRAs tarafından elde reaktivasyonu büyüklüğü ex vivo14,15hücre ilişkilendirilmiş unspliced HIV mRNA (RNA) bize, viral transkripsiyonu, gösterge mütevazı bir artış gözlenmiştir sınırlı oldu. Önemlisi, bu LRAs de gizlice enfekte hücreleri sıklığı bir azalma neden başarısız oldu.
HIV ifade daha verimsiz alışılageldik16 yanı sıra çarpın spliced HIV RNA (MS RNA)17nükleer dışa aktarma hataları tarafından kısıtlanabilir. Böylece, daha güçlü ve farklı yönlerini virüs üretim sonrası entegrasyon etkileyebilir LRAs tanımlayıcı yeni sınıflar ihtiyaç vardır. Buna ek olarak, verimli bir şekilde gecikme süresi tersine çevirmek için en uygun bileşikler tanımlama yardım roman deneyleri geliştirilmesi gereklidir.
Burada, hangi yüksek üretilen iş yaklaşımı HIV LTR tahrik transkripsiyon ve yapıştırma müdahalelerin etkisi işlevsel değerlendirme için kullanan bir iletişim kuralı sunulur. Kısaca, yeni bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir sistem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Şekil 1) akış sitometresi tarafından HIV reaktivasyonu değerlendirmek için kullanılır. Spliced mRNA (2 kb) ifade Discosoma sp. kırmızı (DsRed) Floresan protein ifade için yol açacak iken bu floresan muhabiri, gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade için ifade unspliced HIV mRNA (4 kb) yol açar. Kısaca, biz bir floresan Env-EGFP füzyon protein, gp140unc kullanılır. EGFP, EGFP kodlama dizisi çerçeve ile un cleaved ve kesilmiş bir zarf (Env) şeklinde yerleştirildiği. Değişiklikleri Env ayrılma gp120 ve gp41-EGFP önlenmesi bölünme site ablate ve gp160 protein doğru katlanır kolaylaştırır bir çözünür Env analog oluşturma transmembran etki alanı önce kesecek şekilde tanıtıldı ve EGFP ifadesidir. İfade bir hücre içinde nerede 4 kb env sitoplazmik nükleer ihracat aracılık çekirdeği Rev yerelleştirir mRNA devir duyarlı öğesi (RRE) ile etkileşim ile. Env kesilmesi gp120 ve gp41 ve A7 3′ splice sitesi arasında yatıyor RRE ödün vermeyen. Bu sistemde HIV-1’ın porno versiyonunu donör 4 (SD4) splice ve alıcısı 7 (SA7) splice sonuçları 2 kb üretiminde bir işlevsel olmayan Rev proteinin amino asit 38 kesildi kodlama mRNA erimiş DsRed floresan protein, RevΔ38-DsRed. Kısaca, DsRed, örtüşme uzantısı18tarafından Rev 2nd exon amino asit 38, içine eklenmiştir. Unspliced mRNA nükleer ihracat kolaylaştırmak için Rev (pCMV-RevNL4.3) kodlama bir memeli ifade vektör floresan muhabir yapı (Şekil 2) ile birlikte transfected. Burada açıklanan bu benzersiz muhabir yapı yüksek üretilen iş değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma, ezelî belgili tanımlık lüzum için viral vektörü yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virüs reaktivasyonu ex vivo ölçme zorluk göz önüne alındığında, çok çeşitli modelleri HIV gecikme gizlice dahil olmak üzere çalışma için zaman içinde geliştirilen vitro olarak T hücre-hatları (J Latı, ACH2, U1), temel model istirahat (latent enfeksiyon bulaşmış O’Doherty, Lewin, Greene ve Spina modelleri) ya da pre-harekete geçirmek CD4 + T hücreleri (sanane, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modelleri) tek yuvarlak veya çoğaltma yetkili gazeteci virüsler ile22. Fiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser proje desteği APP1129320 ve programı hibe APP1052979 Avustralya NHMRC tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Adam Wheatley, Doktor Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson ve Michelle Y. Lee temel yapıları ve tavsiye Bu eser başarıyla tamamlanması için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz de DMI akış olanağı personel onların tavsiye ve bu çalışmada kullanılan akış sitometresi korumak cömert yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
