Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.
HIV blijft ongeneeslijke als gevolg van het bestaan van een reservoir van cellen die havens stabiel en latente vorm van het virus, dat blijft onzichtbaar voor het immuunsysteem en is niet gericht door de huidige antiretrovirale therapie (cART). Transcriptie, egaliseren en lamineren is aangetoond dat de versterking van de latentie van de HIV-1 bij rust CD4 + T cellen. Omkering van latentie door het gebruik van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) bij de aanpak van “schok en kill” uitvoerig is onderzocht in een poging om te zuiveren van dit reservoir maar heeft tot nu toe niet aangetoond met enig succes in klinische proeven als gevolg van het gebrek aan ontwikkeling van voldoende kleine moleculen die efficiënt dit reservoir kunnen erover. Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode voor betrouwbaar en efficiënt beoordeling van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van een LTR-gedreven dual kleur verslaggever die het effect van een LRA op transcriptie, egaliseren en lamineren gelijktijdig kunt meten van stroom cytometry. Het protocol hier beschreven is geschikt voor zowel Adherente cellen als de cellen in suspensie. Het is handig voor het testen van een groot aantal drugs in een hoge doorvoer systeem. De methode is technisch eenvoudig te implementeren en rendabel. Bovendien is het gebruik van stroom cytometry zodat kan worden nagegaan van de levensvatbaarheid van de cellen en dus drug toxiciteit op hetzelfde moment.
Ondanks op lange termijn effectieve antiretrovirale therapie aanhoudt HIV in een latente staat als een geïntegreerde provirus in geheugen CD4 + T cellen1. De structuur van de chromatine van de HIV-1-5′ lang terminal herhalen (LTR) promotor en epigenetische aanpassingen zoals Histon methylation en deacetylation door DNA methyltransferases (DNMT) en Histon deacetylases (HDAC) zijn belangrijke mechanismen die leiden tot transcriptionele repressie en dus na integratie latency2,3. Een grote verscheidenheid van latency achteruitrijlicht agenten (lokale en regionale overheden) heeft onderzocht voor hun doeltreffendheid voor het opwekken van de virus productie in vitro en in vivo van latent geïnfecteerde rust CD4 + T cellen4,5,6,7 ,8. Onder de lokale en regionale overheden getest, HDACi (HDAC-remmers) en BET bromodomain remmers (BETis) veroorzaken chromatine-decondensation en de introductie van de positieve transcriptie rek factor b (P-TEFb) respectievelijk, wat leidt tot latere verlichten van de transcriptionele onderdrukking op de 5′ LTR en activering van HIV expressie9,10,11,12,13. De omvang van reactivering bereikt door deze lokale en regionale overheden werd echter beperkt omdat slechts een bescheiden toename van cel-geassocieerde unspliced HIV mRNA (ons RNA), indicatieve van virale transcriptie, ex vivo14,15werd waargenomen. Belangrijk is dat deze lokale en regionale overheden ook niet voor het opwekken van een vermindering van de frequentie van latent geïnfecteerde cellen.
HIV expressie kan verder worden beperkt door inefficiënte splicing16 , alsmede gebreken in nucleaire export van vermenigvuldigen afgesplitste HIV RNA (MS RNA)17. Aldus, identificerende nieuwe klassen van lokale en regionale overheden die krachtiger en kunnen invloed hebben op verschillende aspecten van de virus productie na integratie nodig zijn. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe tests die helpen met het bepalen van de optimale verbindingen om om te keren efficiënt latency is vereist.
Hier, wordt een protocol gepresenteerd, die gebruik maakt van een benadering van de hoge gegevensdoorvoer voor functionele beoordeling van het effect van interventies op HIV LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren. Kortom, een nieuwe LTR-gedreven dual color verslaggever systeem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figuur 1) wordt gebruikt om te beoordelen van HIV reactivering stroom cytometry. In deze TL verslaggever leidt de uitdrukking van mRNA van unspliced HIV (4 kb) tot verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) expressie, terwijl de expressie van afgesplitste mRNA (2 kb) tot de fluorescerende eiwituitdrukking Discosoma sp. rood (DsRed leiden zou). Kort, gebruikten we een fluorescerende Env-EGFP fusieproteïne, gp140unc. EGFP, waar de codering opeenvolging van EGFP werd geplaatst in frame met een VN-gekloofd en afgekapte vorm van de envelop (Env). Wijzigingen aangebracht aan de breukzijde voorkomen de dissociatie van Env in gp120 en gp41-EGFP lasertherapie en afkappen van het eiwit gp160 voorafgaand aan de transmembrane domein maakt een oplosbare Env analoog, dat de juiste vouwen vergemakkelijkt en expressie van EGFP. Op de expressie in een cel, Rev lokaliseert aan de kern waar het bemiddelt de nucleaire-cytoplasmatische export van de 4 kb env mRNA via de interactie met het rev responsief element (RRE). Het afkappen van Env doet geen afbreuk aan de RRE, die tussen gp120 gp41 en de A7 3′ splice site ligt. In dit systeem, splicing bij HIV-1 splice donor 4 (SD4) en splice acceptor 7 (SA7) resulteert in de productie van een 2 kb mRNA codering van een niet-functionele Rev eiwit afgebroken op aminozuur 38 gesmolten aan DsRed TL proteïne, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed werd ingevoegd in de 2nd exon van Rev op aminozuur 38 overlapping extensie18. Om te vergemakkelijken de nucleaire export van unspliced mRNA, was mede een vector van de zoogdieren expressie codering Rev (pCMV-RevNL4.3) transfected met de fluorescerende verslaggever construct (Figuur 2). Deze unieke verslaggever constructie hier beschreven is nuttig in high-throughput beoordeling van HIV transcriptie, egaliseren en lamineren, zonder de noodzaak om het gebruik van virale vectoren.
Gezien de moeilijkheid in het meten van virus reactivering ex vivo, een breed scala van in vitro modellen werden ontwikkeld in de tijd om te bestuderen van HIV latentie met inbegrip van latent geïnfecteerd T-cellijnen (J-Lats, ACH2, U1), primaire modellen van latente infectie van de rust) O’Doherty, Lewin, Greene en Spina modellen) of pre-geactiveerde CD4 + T cellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modellen) met één ronde of replicatie bevoegde verslaggever virussen22. Om het model van…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door projectsubsidie APP1129320 en program grant, APP1052979 van de NHMRC van Australië. Wij danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson en Michelle Y. Lee voor het verstrekken van essentiële constructies en advies voor de succesvolle voltooiing van dit werk. Wij danken het personeel van de DMI Flow faciliteit voor hun advies en genereuze bijstand bij het handhaven van de cytometer van de stroom gebruikt in deze studie.
Cell culture | |||
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry reagents | |||
LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |