إنتاجية عالية في تقييم المختبر من الكمون عكس الوكلاء عن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط
Summary
بروتوكول إنتاجية عالية للتقييم الوظيفي لتنشيط فعالية فيروس نقص المناعة البشرية وتخليصها من بروفيروسيس الكامنة الموصوفة ويطبق اختبار أثر التدخلات بشأن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط. وترد نتائج تمثيلية لتأثير الكمون عكس الوكلاء على النسخ التي يحركها لتر والربط.
Abstract
وما زال فيروس نقص المناعة البشرية المستعصية بسبب وجود مستودع للخلايا التي تأوي شكل مستقر والكامنة للفيروس، الذي يبقى غير مرئية للجهاز المناعي، وهي ليست موجهة بالعلاج المضاد للفيروسات الرجعية الحالية (عربة). قد ثبت النسخ والربط إلى تعزيز زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية-1 في استراحة خلايا CD4 + T. عكس الكمون باستخدام الكمون عكس وكلاء (لراس) في النهج “الصدمة وقتل” درست على نطاق واسع في محاولة لتطهير هذا الخزان ولكن لم تظهر حتى الآن أي نجاح في التجارب السريرية بسبب الافتقار إلى التنمية الصغيرة الكافية الجزيئات التي يمكن التشويش كفاءة هذا الخزان. ينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لموثوقية وكفاءة تقييم الكمون عكس وكلاء (لراس) في النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط. ويستند هذا النهج استخدام يحركها لتر لون مزدوج مراسل وكالة فرانس أنه في نفس الوقت يمكن قياس الأثر جيش الرب للمقاومة على النسخ والربط بالتدفق الخلوي. بروتوكول الموصوفة هنا كاف للخلايا ملتصقة، فضلا عن الخلايا الموجودة في التعليق. أنها مفيدة لاختبار عدد كبير من الأدوية في نظام إنتاجية عالية. الأسلوب من الناحية التقنية البسيطة لتنفيذ وفعالية من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام التدفق الخلوي يسمح تقييم سلامة الخلية وهكذا المخدرات سمية في نفس الوقت.
Introduction
وعلى الرغم من فعالية العلاج المضاد للفيروس طويلة الأجل، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية في حالة كامنة بروفيروس متكاملة في الذاكرة خلايا CD4 + “تي”1. هيكل الكروماتين من فيروس نقص المناعة البشرية-1 5 ‘ المروج تكرار طويلة طرفية (لاتينية) وتعديلات جينية مثل مثلايشن هيستون وديسيتيلاتيون بالحمض النووي ميثيلترانسفيراسيس (دنمت) وهيستون ديسيتيلاسيس (هداك) هي آليات هامة تؤدي إلى النسخي القمع ومن ثم التكامل بعد الكمون2،3. مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكمون عكس وكلاء (لراس) قد تم التحقيق لفعاليتها للحث على إنتاج الفيروس في المختبر وخفية في المجراة من المصابين في استراحة CD4 + “تي” الخلايا4،،من56،7 ،8. بين لراس اختبارها، هداسي (مثبطات HDAC) وبيت برومودومين مثبطات (بيتيس) حمل ديكوندينسيشن الكروماتين والإفراج عن النسخ الإيجابية استطالة عامل ب (P-تيفب) على التوالي، والمؤدية إلى اللاحقة التخفيف من النسخي القمع في 5 ‘ لتر والتنشيط لفيروس نقص المناعة البشرية التعبير9،،من1011،،من1213. بيد أن حجم إعادة التنشيط التي حققتها هذه لراس كانت محدودة، كما لوحظ زيادة متواضعة فقط في الخلية المرتبطة أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (الرنا لنا)، يدل على النسخ الفيروسية، السابقين فيفو14،15. الأهم من ذلك، فشلت هذه لراس أيضا للحث على تخفيض تواتر الخلايا المصابة خفية.
فيروس نقص المناعة البشرية التعبير لا يجوز تقييده كذلك بعدم كفاءة الربط16 فضلا عن عيوب في الصادرات النووية لضرب المقسمة “فيروس الحمض النووي الريبي” (الرنا MS)17. وبالتالي، هناك حاجة إلى تحديد فئات جديدة من لراس التي هي أكثر قوة، ويمكن أن تؤثر على جوانب متميزة من الفيروسات التكامل ما بعد الإنتاج. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب وضع فحوصات الرواية التي تساعد على تحديد المركبات الأمثل لكفاءة عكس الكمون.
ويرد هنا، بروتوكول، التي تستخدم نهجاً الفائق للوظيفية تقييم أثر التدخلات على النسخ التي يحركها “لتر فيروس نقص المناعة البشرية” والربط. وباختصار، لون مزدوجة جديدة يحركها لتر مراسل نظام pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد (الشكل 1) يستخدم لتقييم إعادة تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية بالتدفق الخلوي. في هذا المراسل الفلورسنت، التعبير عن أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (4 كيلوبايت) يؤدي إلى التعبير البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)، بينما التعبير عن مرناً المقسمة (2 kb) سيؤدي إلى تعبير البروتينات الفلورية ديسكوسوما sp. الحمراء (دسريد). بإيجاز، استخدمنا بروتين فلوري انصهار الحياة الفطرية-اجفب، gp140unc. اجفب، حيث كان وضع تسلسل الترميز اجفب في الإطار مع نموذج الأمم المتحدة ملصوق ومبتورا المغلف (الحياة الفطرية). وأدخلت تغييرات يجتذ الموقع الانقسام ومنع الانفصال من الحياة الفطرية في gp120 و gp41-اجفب، واقتطاع البروتين gp160 قبل المجال transmembrane خلق تناظرية الحياة الفطرية القابلة لذوبان، مما يسهل الطي الصحيحة و التعبير عن اجفب. عند التعبير داخل خلية، يموضع Rev لنواة حيث أنها تتوسط الصادرات النووية هيولى من 4 كيلو بايت الحياة الفطرية مرناً عن طريق التفاعل مع عنصر استجابة القس (رر). الاقتطاع من الحياة الفطرية لا يضر رر، التي تقع بين gp120 و gp41، وموقع الوصلة 3 ‘ A7. وفي هذا النظام، الربط في فيروس نقص المناعة البشرية-1 لصق المانحة 4 (SD4) ولصق يقبلون 7 (SA7) النتائج في إنتاج 2 ك. بايت تنصهر مرناً ترميز بروتين Rev غير وظيفية اقتطاع في 38 من الأحماض الأمينية للبروتينات الفلورية دسريد، RevΔ38-دسريد. بإيجاز، كان دسريد إدراج إكسون 2nd من رؤيا في الأحماض الأمينية 38 بتداخل ملحق18. لتسهيل الصادرات النووية مرناً أونسبليسيد، transfected ناقل تعبير الثدييات ترميز Rev (بكمف-القسNL4.3) كان يشترك مع بناء مراسل الفلورسنت (الشكل 2). هذا البناء الفريد مراسل الموصوفة هنا مفيدة في تقييم الفائق لفيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط، دون الحاجة إلى استخدام النواقل الفيروسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظراً لصعوبة قياس تنشيط الفيروس السابقين فيفو، طائفة واسعة من المختبر ووضعت نماذج مع مرور الوقت من أجل دراسة زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية بما في ذلك خفية المصابة خطوط الخلايا T (J-لاتس لاتفيا، ACH2، U1)، النماذج الأولية للعدوى الكامنة ليستريح ( نماذج O’Doherty، لوين، وغرين والمشقوقه) أو خل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل المشروع منحة APP1129320 ومنحة برنامج APP1052979 من “تمويل لأستراليا”. ونحن نشكر الدكتور آدم ويتلي، الدكتور ألكسندر مارينا، والدكتور جيني L. أندرسون وميشيل يوسف لي لتقديم المشورة والبنيات الأساسية للنجاح في إنجاز هذا العمل. ونشكر أيضا موظفي مرفق تدفق DMI لتقديم المشورة والمساعدة السخية للحفاظ على سيتوميتير تدفق المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
