Summary

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Published: November 17, 2018
doi:

Summary

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Abstract

Hem zenginleştirmek ve antijen spesifik T hücreleri genişletmek için bir araç geliştirdik. Bu gibi durumlarda yararlı olabilir A) antijen spesifik T hücrelerinin varlığını tespit, B) antijen spesifik yanıt dinamikleri sonda, C) anlamak için nasıl antijen spesifik yanıt-e doğru hastalık durumu otoimmünite gibi etkiler, D) etrafındaki sisi ortadan türdeş olmayan Yanıt için antijen spesifik ya da E T hücreleri) antijen spesifik hücreleri tedavi için kullanmaktadır. Araç üzerinde bir manyetik parçacık antijen spesifik ve T hücre co-stimulatory sinyalleri eşlenik ve yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) vadeli temel alır. Teknoloji üretmek basit olduğundan, sonuç olarak, bu kolayca diğer laboratuvarlar tarafından kabul edilebilir; Böylece, Buradaki amacımız imalat ve aAPCs sonraki kullanımını ayrıntılı olarak tarif etmektir. Biz aAPCs için antijen spesifik ve co-stimulatory sinyalleri eklemek, onları antijen spesifik T hücreleri için zenginleştirmek için kullanmak ve antijen spesifik T hücreleri genişletin açıklar. Ayrıca, mühendislik tasarım konuları antijen spesifik T hücreleri karakterize ile deneyimimizin deneysel ve biyolojik bilgileri temel alarak vurgular.

Introduction

Birçok immunotherapies yükselişi ile karakterize ve bağışıklık yanıtı kontrol edebilmek için bir ihtiyaç vardır. Özellikle, adaptif bağışıklık yanıtı özgüllük ve dayanıklılık hücrelerin nedeniyle ilgi biridir. Son zamanlarda, antijen reseptör chimeric T hücre tedavileri kanser tedavisi için onaylanmış olan; Ancak, antijen-reseptörleri kanser1olarak belirli antijenleri yerine ortak hücre yüzey antijeni CD19, kapalı dayanır. Özgüllüğü immunotherapies ayrıca denetim ve sınırlı dinamik bağışıklık yanıtı kanser veya otoimmünite içinde anlama eksikliği muzdarip.

Antijen spesifik yanıt eğitim sorunları biridir onların son derece düşük frekanslı, Örn., antijen spesifik T hücrelerdir 1 her 10 /4 106 T hücreleri2,3. Böylece, hangi T araştırmak için hücreler varsa veya Yanıt, hücreleri ya zenginleştirilmiş genişletilmiş ve olması gereken veya onların sinyal kuvvetlendirilmesine gerekir. Pahalı ve zor antijen spesifik hücreleri genişlemesi üzerine odaklanmış güncel teknikler kullanarak besleyici hücreleri korumak. Antijen spesifik T sinyalinin yükseltecek üzerinde odaklanmak güncel teknikler hücreleri, enzim bağlı immunospot (ELISPOT) tahlil gibi bu T hücreleri4yeniden kullanımı sınırla. Son olarak, düşük duyarlılık nedeniyle sık sık bu iki teknik antijen spesifik numaralandırma için Birleşik olarak gerekir.

Bu sorunlara yönelik olarak manyetik nanoparçacık tabanlı yapay antijen sunan hücre (aAPC)5,6,7,8geliştirdik. AAPC bir antijen spesifik sinyal peptid yüklü MHC kompleksi (pMHC) – ve co-stimulatory moleküller – functionalizedÖrneğin., bir anti-CD28 antikor-antijen spesifik T hücreleri hem de zenginleştirmek ve sonra daha sonra kendi genişleme (Şekil 1) teşvik. Parçacıklar böylece olmak hem antijen spesifik elektrodlar karşılamak için özelleştirilmiş henüz deneyler ve hastalar arasında standart maliyet-etkin bir piyasada ürün olabilir. Performans zenginleştirme ve genişleme süreci yüzlerce binlerce kat genişleme antijen spesifik CD8 + T hücreleri için sonuçlarında ve frekansları neden olabilir kadar sadece bir hafta sonra 60 yüzde karakterizasyonu veya büyük terapötik kullanım etkinleştirme hücre sayısı. Burada, biz nanopartikül aAPCs, nanopartikül özellikleri seçiminde bazı kritik tasarımları yapmak tarif nasıl ve yalıtma ve nadir antijen spesifik CD8 + T hücreleri genişleyen bu parçacıklar kullanan bazı tipik sonuçlar gösterilmektedir.

Protocol

Bütün fareler Johns Hopkins Üniversitesi’nin kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan yönergeleri başına muhafaza. 1. istenen antijen peptit dizisi ile dimerik Binbaşı MHC kompleksi immünglobulin füzyon Protein (MHC-Ig) yükleyin. Not: H – 2 Kb kullanıyorsanız: IG, daha sonra takip adım 1. 1 ‘; ayrıntılı iletişim kuralı H kullanıyorsanız-2Db:Ig, daha sonra takip adım 1.2 ile ayrıntılı iletişim kuralı. Etkin peptid sırası …

Representative Results

Başarılı zenginleştirme ve genişleme antijen spesifik T hücrelerinin tamamlamak için peptid yüklü MHC-IG ve co-stimulatory molekülleri başarıyla aAPC parçacık iliştirilmesi gerekir. Parçacık Eki 3 yöntemleri üzerinde bağlı olarak, biz başarılı konjugasyon yordam sonucu (Şekil 5a) temsilcisi bazı veriler sağlar. Nitekim, ligand yoğunluğu çok düşük ise, o zaman olacak bu 100 yukarıdaki ligandlar arasındaki doğrusal Aralık et…

Discussion

Nanopartikül yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) üzerinde esaslı bir roman antijen spesifik T hücre izolasyon teknoloji oluşturduk. Nanopartikül aAPCs peptid-MHC bırakmak antijen spesifik T hücre bağlama ve harekete geçirmek co-stimulatory harekete geçirmek yanında yüzey üzerinde yüklenmiş. aAPCs da paramagnetic ve böylece bir manyetik alanını kullanarak nadir antijen spesifik T hücreleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Biz en iyi duruma getirilmiş ve anahtar nanopartikül özellikleri boyu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.W.H. NIH kanser nanoteknoloji Eğitim Merkezi Johns Hopkins Enstitüsü’nde NanoBioTechnology, Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1232825) ve kemerler Vakfı bursu destek için teşekkürler. Bu eser destek Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland İnovasyon Girişimi ve Coulter Vakfı (JPS) tarafından finanse edildi.

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Play Video

Cite This Article
Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

View Video