Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes
Summary
Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.
Abstract
We hebben een tool om zowel verrijken en uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen ontwikkeld. Dit kan handig zijn in gevallen zoals zijn naar A) detecteren van de aanwezigheid van antigeen-specifieke T-cellen, B) sonde de dynamiek van antigeen-specifieke reacties, C) begrijpen de invloed van antigeen-specifieke reacties op ziekte staat zoals autoimmuniteit, D) demystificeren heterogene Responsie voor antigeen-specifieke T-cellen, of E) gebruik maken van antigeen-specifieke cellen voor therapie. De tool is gebaseerd op een magnetische deeltje dat we conjugaat antigeen-specifieke en T-cel co-stimulatory signalen, en dat we noemen als kunstmatige antigeen presentatie van cellen (aAPCs). Bijgevolg, aangezien de technologie eenvoudig te produceren, het kan gemakkelijk worden aangenomen door andere laboratoria; dus is ons doel hier om te beschrijven in detail de fabricage en het latere gebruik van de aAPCs. We uitleggen hoe u koppelt van antigeen-specifieke en co-stimulatory signalen aan de aAPCs, hoe om ze te verrijken voor antigeen-specifieke T-cellen te gebruiken, en hoe uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen. Bovendien zullen we benadrukken technisch ontwerp overwegingen gebaseerd op experimentele en biologische informatie van onze ervaring met het karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen.
Introduction
Met de opkomst van de vele immuuntherapie is er een behoefte om te kunnen karakteriseren en beheren van de immuunrespons. Met name is de adaptieve immuunrespons van belang vanwege de specificiteit en de duurzaamheid van de cellen. Onlangs, chimeer-antigeen-receptor T celtherapieën zijn goedgekeurd voor kankertherapie; echter zijn de antigeen-receptoren gebaseerd uit het gemeenschappelijk cel surface antigeen CD19, in plaats van de antigenen die specifiek zijn voor de kanker-1. Buiten de specificiteit, kunnen immuuntherapie ook lijden aan het gebrek aan controle en beperkte begrip van de dynamische immuunrespons binnen kanker of autoimmuniteit.
Een van de uitdagingen van het bestuderen van antigeen-specifieke reacties is hun extreem lage frequentie, bijv., antigeen-specifieke T-cellen zijn 1 van elke 104 naar 106 T cellen2,3. Dus, om te onderzoeken welke T cellen aanwezig zijn of reageert, de cellen moeten ofwel worden verrijkt en uitgebreid, of hun signaal kan worden versterkt. Het is duur en moeilijk te handhaven van de cellen van de feeder met behulp van huidige technieken die gericht zijn op de uitbreiding van antigeen-specifieke cellen. Huidige technieken die gericht zijn op het versterken van het signaal van antigeen-specifieke T-cellen, zoals de immunospot van enzyme-linked (ELISPOT) assay, beperken het hergebruik van die T cellen4. Tot slot vanwege lage gevoeligheid moeten deze twee technieken vaak worden gecombineerd voor antigeen-specifieke opsomming.
Om deze kwesties te behandelen, hebben we de magnetische nanoparticle gebaseerde kunstmatige antigeen voorstellende cel (aAPC)5,6,7,8. De aAPC kan worden matiemaatschappij en een antigeen-specifieke signaal-peptide geladen grote histocompatibility complex (pMHC) – co-stimulatory moleculen –bv., een anti-CD28 antilichaam-zowel het verrijken van antigeen-specifieke T-cellen en dan vervolgens stimuleren hun expansie (Figuur 1). De deeltjes kunnen dus een kosteneffectieve off-the-shelf product dat kan worden zowel aangepast aan antigeen-specifieke stimulaties nog gestandaardiseerd over experimenten en patiënten. Uitvoeren van de verrijking en uitbreiding verwerken van resultaten in honderden tot duizenden-voudige expansie van antigeen-specifieke CD8 + T cellen en kan leiden tot frequenties tot 60 procent na één week, waardoor de karakterisering of het therapeutische gebruik van de grote aantal cellen. Hierin, we beschrijven hoe maak je nanoparticle aAPCs, sommige kritische overwegingen bij het kiezen van de nanoparticle eigenschappen, en enkele typische resultaten tonen met behulp van deze deeltjes in isoleren en zeldzame antigeen-specifieke CD8 + T cellen uit te breiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hebben we een nieuwe antigeen-specifieke T celtechnologie van de isolatie op basis van kunstmatige antigeen nanoparticle presenteren cellen (aAPCs). Nanoparticle-aAPCs peptide-geladen MHC op het oppervlak waarmee antigeen-specifieke T cel bindende en activering naast co-stimulatory activeren. aAPCs zijn ook paramagnetisch, en dus kan worden gebruikt voor het verrijken van zeldzame antigeen-specifieke T-cellen met behulp van een magnetisch veld. Wij hebben geoptimaliseerd en studeerde van belangrijke nanoparticle eigensch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jwh bedankt de NIH kanker nanotechnologie Training Center in het Johns Hopkins Instituut voor nanobiotechnologie, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) en de bogen foundation voor de ondersteuning van de fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovatie-initiatief en de Coulter Foundation (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
- Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
- Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
- Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
- Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
- , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
- Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
- Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
- Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
- Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
- Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
- Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
- Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
- Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
- Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).
