N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı
Summary
Bu makalede, protein ifade, arıtma, kristalizasyon ve yapı tayini N-terminal etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve (Plutella xylostella) üzerinden iletişim kuralları açıklar.
Abstract
Güçlü ve verimli böcek böcek ryanodine reseptörleri (RyRs) hedefleme geliştirilmesi tarımsal haşere kontrolü alanında büyük ilgi olmuştur. , Birkaç diamide böcek haşere RyRs ticari hedefleme bugüne kadar olan 2 milyar dolarlık yıllık gelir elde. Ama eylem RyR hedefleme böcek öldürücüler, modu, anlama böcek RyR ilgili yapısal bilgi eksikliği ile sınırlıdır. Bu sırayla anlama zararlıları böcek ilacı direnç gelişimi sınırlar. Diamondback güve (DBM) da diamide böcek öldürücüler direnç göstermek için rapor yok turpgillerden bitkileri dünya çapında, yıkıcı bir zararlı olduğunu. Bu nedenle, roman böcek öldürücüler DBM RyR, özellikle geleneksel diamide bağlama Web sitesinden farklı bir bölge hedefleme hedefleme geliştirmek için pratik büyük önem taşımaktadır. Burada, yapısal olarak RyR DBM üzerinden N-terminal etki alanını tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. X-ışını kristal yapısı moleküler yedek bir çözünürlükte tarafından çözüldü 2,84 Å, hangi, bir beta-trefoil katlama motif ve bir kanat alpha sarmalının gösterir. Bu iletişim kuralı ifade, arıtma ve diğer etki alanları veya proteinler yapısal karakterizasyonu için genel olarak adapte edilebilir.
Introduction
Ryanodine reseptörleri (RyRs) Permeasyon Ca2 + iyonlarının kas hücrelerindeki sarcoplasmic retikulum (SR) membranlar arasında arabuluculuk belirli iyon kanalları vardır. Bu nedenle, işlem kaplin uyarma daralmaya önemli bir rol oynuyorlar. İşlevsel haliyle, bir homo tetramer moleküler kütlesi ile olarak RyR çeviren > her alt birim ~ 5000 amino asit kalıntıları eklenmesi oluşan ile 2 MDa. Memelilerde, üç izoformlarının vardır: RyR1 – kas iskelet tipi, RyR2 kalp kası tipi ve RyR3-ubiquitously farklı dokular1‘ dile getirdi.
Böcekler RyR, kas ve sinir dokusu2‘ de gösterilen tek bir türü yoktur. Böcek RyR memeli RyR2 bir sıra kimliğini yaklaşık % 47 ile daha benzer3. Diamide böcek RyR Lepidoptera ve Coleoptera hedefleyen geliştirilmiştir ve Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) ve Syngenta (cyantraniliprole) gibi büyük şirketler tarafından pazarlanan. Nispeten son başlatılmasından bu yana, diamide böcek böcek öldürücüler en hızlı büyüyen sınıf biri haline gelmiştir. Şu anda, bu üç böcek öldürücüler yıllık satış 2009 yılından bu yana (Agranova) 2 milyar ABD Doları % 50’den fazla bir büyüme oranı ile kesişti.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu böcek öldürücüler4,5,6,7,8kullanımı, birkaç kuşak sonra böceklerde direnç gelişimi bildirdin. Direnç mutasyonlar transmembran etki alanındaki RyRs diamondback güve (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) ve domates leafminer ilgili pozisyonlarda, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) bu bölge göster Bu bölge kanal4,8,9geçişi için kritik olduğu bilinmektedir olarak diamide böcek ilacı bağlamasında dahil olabilir. Bu alanda kapsamlı bir araştırma rağmen diamide böcek öldürücüler tam moleküler mekanizmaları zor kalır. Ayrıca, direnç mutasyonları diamides ile etkileşimi doğrudan veya allosterically etkiler belirsizdir.
Daha önceki çalışmalar memeli türlerden birkaç RyR etki alanı yapısını ve yapısı tam uzunlukta memeli RyR1 ve RyR2 x-ışını kristalografisi ve cryo-elektron mikroskobu, sırasıyla10,11tarafından bildirdin, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Ama şimdiye kadar hiçbir yapısını böcek RyR, bizi moleküler inceliklerini reseptör işlevinin yanı sıra böcek ilacı eylem moleküler mekanizmaları ve böcek ilacı direnç gelişimi anlamak yasaklayan bildirilmiştir.
Bu makale, biz N-terminal β-trefoil etki alanı ryanodine reseptör diamondback güve, yıkıcı bir haşere turpgillerden bitkileri dünya çapında22bulaşmasını gelen yapısal karakterizasyonu için genel bir iletişim kuralı mevcut. Yapı dizayn edilmiştir yayımlanan tavşan RyR1 nöral tüp defekti kristal yapıları23,24ve cryo-EM yapısal modelleri16,17,18,19, göre 20 , 21. bu böcek RyR, hangi kanal geçişi için mekanizma ortaya çıkarır ve uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım kullanarak species-specific böcek öldürücüler geliştirmesi için önemli bir şablon sağlar için bildirilen ilk yüksek çözünürlüklü yapısıdır. Yapısı aydınlatma için ‘altın standart’ protein yapı tayini için atomik çözünürlük yakın olarak kabul edilir x-ışını kristalografisi çalıştırmaya başladık. Kristalizasyon işlem öngörülemeyen ve emek yoğun olmakla birlikte, adım adım bu protokolü araştırmacılar hızlı, arındırmak ve böcek RyR ya da herhangi bir diğer proteinler diğer etki alanlarındaki genel olarak karakterize etmek için yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, recombinantly express, arındırmak, kristalize ve DBM RyR nöral tüp defekti yapısını belirlemek için bu yordamı açıklar. Kristalizasyon için yüksek çözünürlük, saflık ve homojenliği ile protein elde etmek çok önemli bir gereksinimdir. Bizim iletişim kuralında, bir hexahistidine etiketi ve MBP etiketi, ikisi de daha yüksek bir kat saflık elde etmek arıtma için yararlanılabilir içerdiğinden evde beslenen hayvan-28a-HMT vektör kullanmayı seçtiniz. Ayrıca, hedef protein çözün?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma tarafından sağlanan için finansman: Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme Çin Program (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Ulusal Doğa Bilim Vakfı Çin (31320103922, 31230061) ve proje, Ulusal temel araştırma (973) programı Çin (2015CB856500, 2015CB856504). Beamline BL17U1 Shanghai sinkrotron radyasyon tesisi (SSRF), personel için minnettarız.
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
References
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
