Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella
Summary
В этой статье мы опишем протоколы протеина выражение, очистка, кристаллизации и структуры определения N-концевой домен рецептора рианодиновыми от diamondback моли (Plutella xylostella).
Abstract
Разработка мощных и эффективных инсектицидов, ориентация насекомых рианодиновыми рецепторы (RyRs) был большой интерес в области сельскохозяйственными вредителями. На сегодняшний день, несколько diamide инсектициды против вредителей, которые освоено RyRs, которые генерируют годовой доход в 2 миллиарда долларов США. Но понимание действия инсектицидов, RyR ориентация ограничивается отсутствием структурной информации о насекомых RyR. Это в свою очередь ограничивает понимание развития резистентности к инсектицидам в вредителей. Бугорчатая моли (ДБМ) является разрушительных вредителей, уничтожив крестоцветных культур во всем мире, который поступили также показать резистентности к инсектицидам diamide. Таким образом она имеет большое практическое значение для разработки новых инсектицидов, ориентация RyR дБм, особенно ориентация региона отличается от традиционной diamide привязки сайта. Здесь мы представляем протокол для структурно характеристики N-концевой домен RyR от дБм. X-ray Кристаллическая структура была решена путем молекулярной замена с разрешением 2,84 Е, который показывает бета трилистник складной мотив и фланкируя альфа-спираль. Этот протокол может быть адаптирована для выражения, очистки и структурных характеристик других доменов или белков в целом.
Introduction
Рианодиновыми рецепторы (RyRs) являются конкретные ионные каналы, которые посредником проникновение ионов Ca2 + через мембраны саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Таким образом они играют важную роль в сокращении возбуждения муфты процесса. В своей функциональной формы, RyR собирает как гомо Тетрамер с молекулярной массой > 2 MDa, с каждого подразделения, состоящий из ~ 5000 аминокислотных остатков. В млекопитающих, существует три изоформ: RyR1 – скелетных мышц, типа RyR2 – сердечной мышцы и RyR3-повсеместно выражена в различных тканях1.
В насекомых существует только один тип RyR, который выражается в мышечной и нервной ткани2. Насекомое RyR больше похож на млекопитающих RyR2 с идентификатором последовательности около 47%3. Diamide инсектициды, ориентированные на RyR чешуекрылых и Coleoptera разработаны и продаются в крупных компаний, как Bayer (flubendiamide), DuPont (Хлорантранилипрол) и “Сингента” (cyantraniliprole). С момента своего запуска относительно недавно diamide инсектициды стали одним из быстро растущих класса инсектицидов. В настоящее время продажи этих трех инсектицидов ежегодно пересекли 2 миллиарда долларов США с темпами роста более чем на 50% с 2009 года (Agranova).
Недавние исследования сообщили развитие резистентности у насекомых после нескольких поколений использования этих инсектицидов4,5,6,,78. Сопротивление мутаций в трансмембранных доменов RyRs от diamondback моли (ДБМ), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) и соответствующие позиции в томатном яблонный, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) показывают, что регион могут быть вовлечены в diamide инсектицид привязки, как этот регион известен быть критическим для стробирования канала4,8,9. Несмотря на обширные исследования в этой области точные молекулярные механизмы diamide инсектицидов остаются недостижимой. Кроме того неясно, затрагивают ли мутации сопротивления взаимодействия с гидразиды прямо или allosterically.
Ранее проведенные исследования сообщили структуру нескольких доменов RyR от видов млекопитающих и структура полнометражных RyR1 млекопитающих и RyR2 рентгеноструктурного анализа и крио электронная микроскопия, соответственно10,11, 12,13,14,,1516,,1718,19,20,21 . Но пока что, нет структуры насекомых RyR сообщалось, который запрещает нам понимание молекулярных тонкости функции рецепторов, а также молекулярные механизмы действия инсектицидов и развития резистентности к инсектицидам.
В этой рукописи мы представляем обобщенных протокол для структурной характеристики N-терминальный β-трилистник домена рецептора рианодиновыми от моли diamondback, разрушительных вредителей, заражая крестоцветных культур во всем мире22. Конструкция была разработана согласно опубликованной кролик RyR1 NTD кристалл структур23,24и крио EM структурной модели16,,1718,19, 20 , 21. это первый разрешением структура для насекомых RyR, который раскрывает механизм для стробирования канала и предоставляет шаблон важные для развития вегетационных инсектицидов, с использованием проектирования на основе структуры наркотиков. Для разяснения структуры мы заняты рентгеноструктурного анализа, который рассматривается как «золотой стандарт» для определения структуры белка в вблизи атомных резолюции. Хотя процесс кристаллизации является непредсказуемым и трудоемкий, этот шаг за шагом протокол поможет исследователям выразить, очищают и в целом характеризуют другие домены насекомое RyR или любые другие белки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описать процедуру recombinantly выразить, очищают, кристаллизация и определить структуру дБм RyR NTD. Для кристаллизации важнейшее требование заключается в получении белки с высокой растворимости, чистоты и однородности. В нашем протокол мы решили использовать ПЭТ 28a-HMT вектор, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этого исследования была предоставлена: Национальный исследовательский ключ и Программа развития Китая (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), национальный характер науки фонд Китая (31320103922, 31230061) и программа проекта национальных фундаментальных исследований (973) Китай (2015CB856500, 2015CB856504). Мы благодарны сотрудникам на излучение BL17U1 на объекте Шанхай синхротронного излучения (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
References
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
