التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا
Summary
في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكولات تحديد التعبير وتنقية وبلورة وبنية البروتين المجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من فراشة diamondback (إكسيلوستيلا بلوتيلا).
Abstract
قد تم تطوير مبيدات حشرية قوية وفعالة تستهدف مستقبلات ريانوديني الحشرات (ريرس) من اهتمام كبير في مجال السيطرة على الآفات الزراعية. حتى الآن، العديد من مبيدات الحشرات دياميدي تستهدف مكافحة الآفات قد تم تسويقها ريرس، التي تدر الدخل السنوي 2 بیلیون دولار أمريكي. ولكن فهم طريقة عمل المبيدات الحشرية استهداف RyR محدودة بسبب الافتقار إلى المعلومات الهيكلية المتعلقة بالحشرات RyR. هذا بدوره يحد من فهم التنمية لمقاومة المبيدات الحشرية في الآفات. العثة diamondback (DBM) هو آفة مدمرة تدمير المحاصيل الصليبية في العالم، الذي ذكر أيضا تبدي مقاومة للمبيدات الحشرية دياميدي. ولذلك، أنها ذات أهمية عملية كبيرة لتطوير المبيدات الحشرية رواية استهداف RyR ديسيبل، تستهدف خصوصا منطقة مختلفة من موقع الربط دياميدي التقليدية. نقدم هنا، بروتوكولا لوصف المجال الطرفي ن من RyR من ديسيبل هيكلياً. بنية بلورية الأشعة السينية تم حلها عن طريق الاستبدال الجزيئي بدقة من 2.84، الذي يوضح فكرة قابلة لطي بيتا-البرسيم والحلزون ألفا ترافقه. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للتعبير، وتنقية وتوصيف الهيكلية للبروتينات أو المجالات الأخرى بشكل عام.
Introduction
مستقبلات ريانوديني (ريرس) هي قنوات أيون محددة، والتوسط تخلل Ca2 + الأيونات عبر الأغشية شبكية الشبكة (SR) في خلايا العضلات. ولذلك، أنها تلعب دوراً مهما في اقتران عملية انكماش الإثارة. في شكله الوظيفي، تجمع RyR هومو تيترامير مع كتلة جزيئية من > 2 نجمة داود الحمراء، مع كل وحدة فرعية تتألف من بقايا الأحماض الأمينية ~ 5000. في الثدييات، هناك ثلاثة إيسوفورمس: RyR1-نوع الهيكل العظمى والعضلات وعضلة القلب نوع RyR2-وأعربت عن أوبيكويتوسلي في أنسجة مختلفة1-RyR3.
في الحشرات هناك نوع واحد فقط من RyR، التي يعبر عنها في أنسجة العضلات والجهاز العصبي2. RyR الحشرات أكثر مماثلة للثدييات RyR2 مع هوية تسلسل من حوالي 47%3. تم تطوير مبيدات الحشرات دياميدي استهداف RyR قشريات الجناح و Coleoptera وتسويقها من قبل شركات كبرى مثل باير (فلوبيندياميدي)، دوبون (تشلورانترانيليبرولي) وسينجينتا (سيانترانيليبرولي). منذ إطلاقها مؤخرا نسبيا، أصبحت المبيدات الحشرية دياميدي واحدة من الفئة الأسرع نمواً من المبيدات الحشرية. حاليا، تجاوزت المبيعات من هذه المبيدات الحشرية ثلاثة سنوياً 2 بیلیون دولار أمريكي بمعدل نمو بلغ أكثر من 50% منذ 2009 (أجرانوفا).
وأفادت الدراسات الأخيرة وضع المقاومة في الحشرات بعد بضعة أجيال من استخدام هذه المبيدات الحشرية4،،من56،،من78. المقاومة الطفرات في المجال ترانسميمبراني من ريرس من العثة diamondback (ديسيبل)، إكسيلوستيلا بلوتيلا (G4946E، I4790M) والمواقف المقابلة في نافقة أوراق الحمضيات الطماطم, توتا absoluta (G4903E، I4746M) تبين أن المنطقة قد يكون متورطا في ربط المبيد الحشري دياميدي كما هو معروف في هذه المنطقة أن تكون حاسمة بالنسبة النابضة للقناة4،،من89. على الرغم من بحوث مستفيضة في هذا المجال، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة للمبيدات الحشرية دياميدي بعيدة المنال. وعلاوة على ذلك، من غير الواضح ما إذا كانت تؤثر الطفرات المقاومة على التفاعلات مع دياميديس اللوستيريكالي مباشرة أو غير مباشرة.
وأفادت الدراسات السابقة بنية المجالات RyR العديد من أنواع الثدييات، وهيكل كامل طول RyR1 الثدييات و RyR2 بعلم البلورات بالأشعة السينية والميكروسكوب الإلكتروني cryo، على التوالي10،11، 12،13،،من1415،16،17،،من1819،20،21 . ولكن حتى الآن، لا يوجد هيكل الحشرات RyR لم يبلغ، التي تحظر لنا من فهم تعقيدات الجزيئية لوظيفة مستقبلات فضلا عن الآليات الجزيئية لعمل المبيدات الحشرية والتنمية لمقاومة المبيدات الحشرية.
في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول معمم لتوصيف الهيكلي الطرفي ن β-البرسيم المجال من مستقبلات ريانوديني من العثة diamondback، الآفات مدمرة إصابة المحاصيل الصليبية في العالم22. تم تصميم بنية وفقا لأرنب المنشورة RyR1 NTD كريستال هياكل23،24والبرد-م النماذج الهيكلية16،17،،من1819، 20 , 21-هذا هو هيكل عالي الاستبانة الأولى ذكرت للحشرات RyR، الذي يكشف عن إليه لقناة النابضة ويقدم نموذجا هاما لتطوير المبيدات الحشرية إبلاغها باستخدام المخدرات على أساس هيكل تصميم. لتوضيح الهيكل، استخدمنا علم البلورات بالأشعة السينية، الذي يعتبر بمثابة ‘المعيار الذهبي’ لتصميم هيكل البروتين في القرب من القرار الذري. على الرغم من أن عملية تبلور يمكن التنبؤ بها وكثيفة العمالة، وهذا البروتوكول خطوة بخطوة ستساعد الباحثين التعبير عن وتنقية وتوصيف مجالات أخرى من الحشرات RyR أو غيرها من البروتينات بشكل عام.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، ونحن تصف الإجراء الذي ريكومبينانتلي إكسبريس وتنقية وبلورة وتحديد هيكل ديسيبل RyR NTD. للتبلور، شرط حاسم للحصول على البروتينات مع الذوبان العالية والنقاء والتجانس. لدينا بروتوكول، اخترنا أن استخدام ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف-جرارات كما أنه يحتوي على علامة هيكساهيستيديني …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تمويل هذه البحوث المقدمة: الوطنية مفتاح البحث وبرنامج التنمية للصين (2017YFD0201400, 2017YFD0201403) والوطنية طبيعة مؤسسة العلوم الصينية (31320103922، 31230061) وبرنامج “المشروع للبحوث الأساسية الوطنية” (973) الصين (2015CB856500, 2015CB856504). ونحن ممتنون للموظفين بشأن بيمليني BL17U1 في شانغهاي الإشعاع السنكروتروني مرفق (سرف).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
References
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
