מבוסס-מורפולוגיה ההבחנה בין בריא פתולוגיים תאים התמרת פורייה ניצול ומפות התארגנות עצמית
Summary
כאן, אנו מספקים זרימת עבודה המאפשר זיהוי תאים בריאים ופתולוגיים בהתבסס על צורתם תלת-ממדי. אנו מתארים תהליך השימוש מתאר הקרנה 2D מבוססת על משטחים 3D לאמן מפה העצמי אשר יספקו קיבוץ באשכולות אובייקטיבית של אוכלוסיות תאים ובדוקים.
Abstract
את המראה ואת התנועות של תאים חיסוניים מונעים על ידי הסביבה שלהם. כתגובה לפלישה הפתוגן תאים חיסוניים גייסו לאתר של דלקת, מופעלים כדי למנוע מריחה נוספת של הפלישה. זה משתקף גם על-ידי שינוי אופן הפעולה ואת המראה מורפולוגי של תאים חיסוניים. ברקמה סרטנית, נצפו שינויים morphokinetic דומים בהתנהגותם של תאים microglial: מיקרוגלייה אינטרה-tumoral יש פחות מורכב צורות תלת-ממדי, נתקל קנים פחות תהליכים תאיים, ולעבור במהירות רבה יותר מאשר אלה בריא רקמות. בחינת מאפייני morphokinetic כזו דורשת טכניקות במיקרוסקופ תלת-ממדית מורכבת, אשר יכול להיות מאתגר ביותר בעת ביצוע longitudinally. לכן, ההקלטה של צורה תלת-ממדית סטטי של תא הוא הרבה יותר פשוט, כי זה אינו דורש מדידות intravital ולא ניתן לבצע רקמת נכרת גם כן. עם זאת, הוא חיוני להחזיק כלי ניתוח המאפשרים את תיאור מהיר ומדויק של צורות תלת-ממד ומאפשר את הסיווג אבחון של דגימות רקמה פתוגניים ובריאה על סמך מידע סטטי, הקשורות צורה. כאן, אנו מציגים את ערכת כלים מנתח את הרכיבים פורייה בדידה של החלוקה לרמות של קבוצת בהקרנת 2D 3D תא משטחים באמצעות מפות העצמי. היישום של שיטות בינה מלאכותית מאפשרת המסגרת שלנו ללמוד על צורות שונות של תא, כאשר היא חלה על דגימות רקמה יותר ויותר, בעוד שזרימת העבודה נשאר פשוט.
Introduction
נחישות בזמן, פשוט ומדויק על מצב פתולוגי של רקמה ביולוגית היא של הריבית הגבוהה ביותר במחקר ביו-רפואי. העכבר מודלים מספקים את האמצעים ללמוד מגוון של מצבים פתולוגיים, כמו החיסון תגובות או התפתחות סרטן, בשילוב עם 3D מורכבים וטכניקות מיקרוסקופ D 4 (3 ממדים מרחביים וזמן). מחקרים מיקרוסקופ ניתן שבוצעו באמצעות intravital או רקמות טוחנות פוטון 2 מיקרוסקופ, מיקרוסקופ אור גיליונות, ולעומק ברקמות מוגבלת של 100 מיקרומטר-מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית. על מנת לקבל מידע הקשור לזמן על התנהגות התאים בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגית, יש צורך לנטר את הרקמה לתקופה ממושכת של זמן, אשר בדרך כלל דורשת intravital1,הדמיה2 . באופן טבעי, תחולתה של טכניקה זו מוגבלת מודלים בעלי חיים בגלל invasiveness שלה. טכניקות פולשני זמינים גם עבור יישומים האנושי, כולל מגוון שיטות טומוגרפיה ממוחשבת (MSOT, CT, וכו ‘), אך כל השיטות שאין צורך מרחבית – והרזולוציה לעיתים קרובות הטמפורלי-ללמוד התנהגות ברמה התאית.
מידע סטטי לגבי המראה של תאים עשויים להיות נגישים בקלות רבה יותר באמצעות 3D שונים בטכניקות הדמיה להורג ב טוחנות דגימות רקמה. . כאן, התנהגות קינטי של התאים לא נמדד, ולכן יש צורך לאמץ טכניקות ניתוח הרומן כי הם מסוגלים לקבוע את מצב פתוגניים של התאים שנבדקו על סמך שלהם מורפולוגיה3. גישה כזו שימשה לקשר התנהגות פתולוגית-4,–5,–6תאים צורות ומרקמים רקמות.
בשיטה החדשה המתוארים כאן, התאים משוחזרים כמו משטחים תלת-ממד, הצורה שלהם מאופיין באמצעות 3D-כדי-2D הקרנות הינם רצופים מבוססי פורייה הפריפריה-צורה ניתוח7,8. על-ידי הפחתת הממדים בין 3 ל- 2, הבעיה היא פשוטה. זה גם אפשרי לאפיין את המשטחים תא תלת-ממד על-ידי החלת ניתוח הרמוניות, כפי שנהגו לעשות תמונות רפואיות9. עם זאת, הרמוניות לא מסתדר עם צורות חדות מחוספס, הדורשים רשת מידה מרובה שתוקם על פני הספרה יחידה. בנוסף, מספר רכיבים הדרושים הרמוניות יכול להיות גדול (50-70), עם החישובים שבבסיס מאוד תובעניים ואת התוצאות קשה לפרש10,11,12.
בשיטה שלנו החדש המוצע, הפעילות מצטמצמת לסדרה של צורה דו-ממדית תיאורים, איפה המספר של ההקרנות 2D עד באנליסט, ניתן להתאים בהתאם למורכבותו של הצורה התלת-ממדית. ההשתקפויות נוצרות אוטומטית באמצעות קובץ script פיתון הפועל בתוך כלי אנימציה תלת מימדית. ההשתקפויות 2D מתוארים על ידי הרכיבים שינוי צורה (DFT) פורייה בדידה של הפריפריה שלהם, מחושב על ידי תוסף13 פיג’י זה מסופק כאן כחלק מחבילת התוכנה שלנו. DFT חלה כאן על מנת לפרק את קווי המתאר מורכבת של התא לתוך סדרה של פונקציות חטא ו- cos. בדרך זו, אנו יכולים לתאר את קווי המתאר עם מספר קטן יחסית של רכיבים DFT, ובכך להקטין את המורכבות של הבעיה (עבור עוד פרטים ראו סעיף משוואות). הרכיבים DFT מוכנסים לתוך מפת העצמי מיומן (סום14), איפה קיומה של צורה אשכולות יכול להיות אובייקטיבי נבדקו8. ל- SOMs לספק כלי למידה מודרכת ולמידה תחרותי מהשדה של בינה מלאכותית. הם מורכבים של מערך מקושר של נוירונים מלאכותיים אשר מתקשרים אחד עם השני באמצעות הפונקציה מרחק השכונה משוקלל. המערכת העצבית מגיב האלמנט הראשון ערכת הנתונים קלט, הנוירונים תגובה של מי הוא החזק ביותר “קיבוץ” קרוב אחד לשני. מערכת עצבית מקבל יותר ויותר קלט, נוירונים נתונים שוב ושוב להגיב בחריפות להתחיל להקים אשכול מוגדרת היטב בתוך המערכת. לאחר הכשרה מתאימה ב- dataset גדול המכיל מידע צורה דו-ממדית בצורה של קבוצה של רכיבים DFT, DFT רכיבים כל תא בודד ניתן להכניס ה-SOM מיומן ולחשוף אם התא סביר שייך בריא או קבוצת תאים פתוגניים. אנו מצפים כלי כה להיות תוספת נהדרת לשיטות של אבחון מדעית וקלינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי מצבים פתולוגיים שעלולים באמצעות דגימות רקמה קטן, ללא פגע, יש חשיבות גבוהה. טכניקות אלה יבטיחו לתגובה בזמן המחלות הזיהומיות, אגרסיביים סוגי סרטן. התגובות קינטי, מורפולוגיים של תאים חיסוניים שונים, למשל, מיקרוגלייה ו מקרופאגים, האופייניים של התגובה החיסונית של הגוף. אמנם ברוב המקרים זה לא מעשי או אפשרי לפקח על אופן הפעולה קינטי של תאים אלה, זה די פשוט לרכוש תמונות תלת-ממדי כדי לאחזר את צורתם. בדרך כלל, תאים חיסוניים מניח צורה מורכבת רקמה בריאה ובטופס לחשבוני תחת תנאים מודלק או סרטניים18. בעוד המאפיינים תלויי-זמן של שינוי צורה כזו היה מוסיף להבנת התפתחות התגובה החיסונית, שימוש רק הצורה התלת-ממדית של נציג קבוצת תאים ניתן גם מספיקות לקבוע את טיבה בריא או פתולוגי של הרקמה.
אפיון השטח תלת-ממדי של תא אינה משימה פשוטה. היישום של הרמוניות היא דרך לייצג את משטח תלת-ממד עם מספר גדול יחסית (50-70) של רכיבים11,12. בנוסף, הקובע את הרמוניות יקר שהמפתחות; הקרנת צורות מורכבות מאוד על גבי לספרה יחידה בלתי אפשרי או קשה מאוד בשל הצורך להחיל רשתות מרובות של טוהר שונים על פני הספרה יחידה; לבסוף, הפרשנות משמעות של הספקטרום של רכיבי הרמוניות רחוקה מלהיות טריוויאלית.
בעבודתנו המובאת כאן, נחליף את המשימה הקשה של ניתוח פני שטח תלת-ממד ישירה בגישה פשוטה יותר של שימוש בהקרנת 2D השטח המקורי כדי לקבל מידע מורפולוגי מספיק כדי לזהות מצבים פיפטות. הפגנו בכל שלב של זרימת עבודה זו באמצעות מיקרוסקופ 3D נתונים מתאי מיאלואידית, בעוד מצביע בבירור כי כל השלבים היו פשוטות להשלים, המפות 2-ממדי וכתוצאה מכך היו קלים לפירוש.
באופן טבעי, הקרנה 3D-כדי-2D תוביל לאובדן מידע על המבנה של פני השטח. ב- dataset שלנו דוגמה של מיקרוגלייה במודל הגידול קורטיקלית של עכברים, זה הספיק כדי להשתמש שש זוויות בעת יצירת ההשתקפויות 2D. עם זאת, צורות מורכבות יותר, או פחות בולט שינויים מורפולוגיים עשויים לדרוש כי מספר גדול יותר של הקרנות נוצרו כדי להיות אמינה לזהות קבוצות תאים עם משתמשת מסיבה זו, הגישה שלנו נועד להיות מסוגל ליצור ולנתח כל מספר של הקרנות. פשוט על ידי בחירת מספר גבוה יותר של תחזיות עבור צורות מורכבות יותר, זה אפשרי לשנות את קנה המידה של אובדן מידע למינימום נסבל. לדוגמה, סוג התא שמעצבת דמות 4a , 4b ידרוש מספר גדול יותר של הקרנות כדי לייצג את המשטח מורכב כהלכה.
כמו כל שיטה משוער, זרימת העבודה המוצעת בזאת היה כנגדם יש התוצאות של תהליך מיון ידני מיקרוגלייה18. התוצאות שהוצגו קודם לכן אישר את המהימנות של זרימת עבודה אוטומטית. יתר על כן, זרימת העבודה הוא יעיל יותר זמן, לעומת ניתוח קונבנציונלי. המומחה הרפואי אשר מסווגים את התאים מיקרוגלייה ידנית צורך כ- 4 שבועות והניתוח של ערכת הנתונים, ואילו את זרימת העבודה שלנו צריך רק כ- 1 יום. החוסן של הגישה שלנו הוכח בבירור גם על ידי הפארמצבטית של ה-SOM מיומן לקבוצת משנה של נתונים שייך סוג התא אותו אך לא שימש הרכבת ה-SOM, כפי הצג ב- c איור 3.
אף-על-פי הגישה שלנו לקחו בחשבון מידע קינטי, בדקנו את השפעת עיתוי על ניתוח צורה מבוססת-DFT. הדוגמה הטיפוסית להתנהגות תלויי-זמן נמצא בקרב האוכלוסייה תא ניידים, איפה התרומה של הרכיבים DFT אינדקס גבוה יותר היה בבירור הנצפה, כמו באיור 4a. זה דורש תשומת לב החשיבות של ניצול מספר גבוה מספיק מרכיבים DFT בהתמודדות עם סוגי תאים שסביר להתנהג בצורה מאוד תלויי-זמן. בשל הטבע אוטומטי מהירות ביצוע גבוהה של כלי תוכנה שלנו, המספר מוגברת של הרכיבים DFT ותחזיות יגדיל את הדיוק והאמינות של התוצאות, בזמן שהם לא ניכרת יעכב את הביצועים חישובית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים בנימין קראוס על דיון פורה והתמיכה שלו. המחברים נוספת תודה רוברט גינתר שלו בסיוע מיקרוסקופ תא חי.
העבודה נתמכה על ידי סיוע כספי DFG NI1167/3-1 (ג’ימי) כדי R.N. ותמיכה Z.C., DFG פיננסיים CRC 1278 PolyTarget פרוייקט Z01 Z.C., C01 ב TRR130 R.N., SFB633, TRR130, Exc257 A.E.H., J.B.S. BfR סיפק תמיכה מגזר SFP1322-642 עבור F.L.K וא. ל.
Materials
| Imaris 9.1.2, software | Bitplane, Zürich, Switzerland | v.9.1.2 | 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us! |
| Blender 2.75a, software | https://www.blender.org/ | v.2.75a | 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python |
| Fiji /ImageJ, software | https://fiji.sc/ | ImageJ v.1.52b | Open source multi-D image analysis toolkit |
| MATLAB | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | General computational mathematical software |
| MATLAB Machine Learning kit | MathWorks, www.mathworks.com | R2017b | Can only be used together with MATLAB |
| Fiji plugins: SHADE | https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis | v.1.0 | |
| Fiji plugins: ActiveContour | http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start | absnake2 | |
| Computer | Any | NA | See Imaris instructions for minimum computer requirements |
References
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E. Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy. Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).
- Ho, S. Y., et al. NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery. BMC Bioinformatics. 12, 230 (2011).
- Yin, Z., et al. A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes. Nature Cell Biology. 15 (7), 860 (2013).
- Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter. Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).
- Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. Joint modeling of cell and nuclear shape variation. Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).
- Wang, S. -. H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -. D. Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm. Entropy. 20 (4), 254 (2018).
- Kriegel, F. L., et al. Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps. Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).
- Styner, M., et al. Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM. Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).
- El-Baz, A., et al. 3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).
- Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia. Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).
- Kruggel, F. Robust parametrization of brain surface meshes. Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kohonen, T. Essentials of the self-organizing map. Neural Networks. 37, 52-65 (2013).
- Andrey, P., Boudier, T. Adaptive Active Contours. ImageJ user and developer conference. , (2006).
- Burger, W., Burge, M. J. . Principles of Digital Image Processing. , (2013).
- Lestrel, P. E. . Fourier Descriptors and their Applications in Biology. , (2008).
- Bayerl, S. H., et al. Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia. Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).
