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Cancer Research

Morphologie-basierte Unterscheidung zwischen gesunden und pathologischen Zellen mittels Fourier-Transformationen und Self-Organizing Maps

Published: October 28, 2018
doi:
10.3791/58543
, , , , , , ,
1Department of Chemical and Product Safety,German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 2Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ) Berlin, a Leibniz Institute, 3Charité Universitätsmedizin Berlin, 4Applied Systems Biology,Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology Hans Knöll Institute

Summary

Hier bieten wir einen Workflow, der die Identifizierung von gesunden und pathologischen Zellen basierend auf ihre 3-dimensionale Form erlaubt. Wir beschreiben den Prozess der Verwendung 2D-Projektion Umrisse anhand der 3D-Oberflächen, um ein Self-Organizing-Map zu trainieren, die Objektive clustering der untersuchten Zellpopulationen bieten wird.

Abstract

Das Aussehen und die Bewegungen der Immunzellen werden von ihrer Umgebung angetrieben. Als Reaktion auf eine Invasion der Erreger die Immunzellen werden rekrutiert, an den Ort der Entzündung und werden aktiviert, um eine weitere Ausbreitung der Invasion zu verhindern. Dies spiegelt sich auch durch Veränderungen in das Verhalten und die morphologische Darstellung der Immunzellen. In Krebsgewebe, haben ähnliche Morphokinetic Veränderungen im Verhalten der Mikroglia-Zellen beobachtet worden: Intra-Tumor Mikroglia haben weniger komplexe 3-dimensionale Formen, weniger verzweigte zelluläre Prozesse, und bewegen Sie sich schneller als in gesunden Gewebe. Die Prüfung solcher Morphokinetic Eigenschaften erfordert komplexe 3D Mikroskopiertechniken, die extrem schwierig, wenn längs ausgeführt werden können. Daher ist die Aufnahme einer statischen 3D Form einer Zelle viel einfacher, weil dies keine intravitalen Messungen erfordert und ausgeschnittenen Gewebe sowie ausgeführt werden kann. Jedoch es ist unerlässlich, Analyse-Tools zu besitzen, die es die schnelle und präzise Beschreibung der 3D Formen ermöglichen und die diagnostische Klassifizierung von gesunden und pathogenen Gewebeproben basiert ausschließlich auf statische, formgebundene Informationen ermöglicht. Hier präsentieren wir eine Toolkit, der die diskrete Fourier-Komponenten analysiert die Gliederung eines Satzes von 2D Projektionen der 3D Oberflächen Zelle über Self-Organizing Maps. Die Anwendung der Methoden der künstlichen Intelligenz ermöglicht unser Framework zu verschiedenen Zellformen erfahren, wie es mehr und mehr Gewebeproben angewendet wird, während der Workflow einfach bleibt.

Introduction

Zeitnah, einfach und präzise Bestimmung des pathologischen Status von biologischem Gewebe ist von höchstem Interesse in der biomedizinischen Forschung. Maus-Modelle bieten die Möglichkeit, eine Reihe von pathologischen Zuständen, z. B. Immunreaktionen oder Krebsentstehung in Kombination mit komplexen 3D und 4D (3 Raumdimensionen und Zeit) Mikroskopiertechniken zu studieren. Mikroskopie Studien kann durchgeführt über intravitalen oder herausgeschnitten-Gewebe 2-Photonen-Mikroskopie, Licht-Blatt Mikroskopie und – bis zu einer begrenzten Gewebe Tiefe von ca. 100 µm-konfokalen Mikroskopie. Um Informationen über die Zellen Verhalten unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen haben, ist es notwendig, das Gewebe für einen längeren Zeitraum hinweg, zu überwachen, die erfordert in der Regel intravitalen bildgebenden1,2 . Natürlich ist die Anwendbarkeit dieser Technik beschränkt sich auf Tiermodelle aufgrund ihrer Invasivität. Nicht-invasive Techniken sind auch für menschliche Anwendungen, einschließlich einer Vielzahl von Methoden der Tomographie (MSOT, CT, etc.) zur Verfügung, aber diese Methoden alle fehlt die notwendige räumliche- und oft Zeitauflösung, Verhalten auf der zellulären Ebene zu studieren.

Statische Informationen über das Aussehen der Zellen möglicherweise leichter erreichbar über verschiedene 3D bildgebende Verfahren ausgeführt auf herausgeschnitten Gewebeproben. Hier das kinetische Verhalten der Zellen wird nicht gemessen, so ist es erforderlich, neue Analysetechniken zu erlassen, die den pathogenen Status der untersuchten Zellen allein aufgrund ihrer Morphologie3bestimmen können. Ein solcher Ansatz wurde verwendet, um pathologisches Verhalten4,5,6Cell Formen und Gewebe Texturen verknüpfen.

In der neuen Technik, die hier beschrieben wird die Zellen werden als 3D Oberflächen rekonstruiert und ihre Formen sind charakterisiert durch 3D-2D Projektionen und aufeinanderfolgenden Fourier-basierte Peripherie-Form Analyse7,8. Durch die Abmessungen von 3 auf 2 zu reduzieren, wird das Problem vereinfacht. Es ist auch möglich, die Zelloberflächen in 3D durch die Anwendung von kugelförmigen harmonischen Analyse, zu charakterisieren, wie es für medizinische Bilder9getan hat. Jedoch kugelförmige Harmonik nicht scharfe und schroffe Formen, behandeln auch erfordern ein Multi-Skalen-Raster auf der Einheitskugel eingerichtet werden. Darüber hinaus kann die Anzahl der notwendigen sphärischen Harmonien Komponenten werden groß (50-70), mit den zugrunde liegenden Berechnungen sehr anspruchsvoll und schwer zu10,11,12interpretieren die Ergebnisse.

Mit unserer neu vorgeschlagene Methode ist die Aufgabe, eine Reihe von 2D-Form Beschreibungen, reduziert, wo die Zahl der 2D Projektionen liegt an der Analytiker und kann je nach Komplexität der 3D Form angepasst werden. Die Projektionen werden automatisch generiert über ein Python-Skript, das in einem 3D Animationstool ausgeführt wird. Die 2D Projektionen werden beschrieben durch die diskrete Fourier-Transformation (DFT) Komponenten ihrer Peripherie, berechnet, indem ein Fidschi-13 -Plugin zur Verfügung gestellt wird hier als Teil unserer Softwarepaket. Die DFT wird hier angewandt, um die komplexe Umrisse der Zelle in eine Reihe von sin und cos Funktionen zu zerlegen. Auf diese Weise können wir den Umriss mit einer relativ kleinen Anzahl DFT Komponenten beschreiben, wodurch die Komplexität des Problems (für weitere Details siehe Abschnitt Gleichungen). Die DFT-Komponenten stellen wir in eine ausgebildete Self-Organizing-Map (SOM14), wo die Existenz der Form können Objektiv Cluster sein8getestet. SOMs sind wettbewerbsfähig und unüberwachten Lernens Tools aus dem Bereich der künstlichen Intelligenz. Sie bestehen aus einer verknüpften Palette von künstlichen Neuronen, die miteinander über eine gewichtete Nachbarschaft Abstandsfunktion kommunizieren. Das neuronale System reagiert auf das erste Element der Eingabe-Dataset und die Neuronen, deren Antwort das stärkste ist “gruppiert” einander näher. Wie das neurale System mehr und mehr Eingang erhält, beginnen Daten Neuronen, die immer wieder stark reagieren, gut definierten Cluster innerhalb des Systems zu bilden. Nach dem richtigen Training auf einem großen Datensatz, der 2D-Form Informationen in Form eines Satzes von DFT Komponenten enthält, jede einzelne Zelle DFT Komponenten können der geschulte SOM umgesetzt werden und zeigen, ob die Zelle wahrscheinlich zu gesunden oder pathogenen Zellgruppe gehört. Wir erwarten, dass solches Tool, eine große Bereicherung für die Methoden der wissenschaftlichen und klinischen Diagnostik zu werden.

Protocol

(1) Protokollanforderungen Erhalten Sie hochauflösende deconvolved dreidimensionale (3D) Mikroskopie Daten deconvolved in Übereinstimmung mit dem Nyquist-Kriterium mit einem Samplingintervall mindestens zweimal die höchste Ortsfrequenz der Probe um ein hochauflösendes Bild zu erhalten. Verwenden Sie 3D Rendering-Software für die Flächenrückführung und Export. 3D Animationssoftware lauffähig Python-Skripten verwenden (das Python-Skript aus dem Github Repository heruntergeladen werden: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis), 2D Projektionen schaffen. Verwenden Sie Fidschi13 2D Projektionen zu analysieren und extrahieren Sie die DFT-Komponenten. Verwenden Sie die aktuelle Verteilung der Fidschi-Inseln. Existiert bereits eine installierte Version von Fidschi, stellen Sie sicher, dass die installierte Version die neueste ist. Dies kann leicht erreicht werden, indem man die helfen | Update -Option. Verwenden Sie die Active Contour Plugin15, die kann von Http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start heruntergeladen werden und in den Plugins-Ordner kopiert werden sollen. Laden Sie die Schatten Fidschi-Plugin von Github Repository und in den Plugins-Ordner kopieren. Verwenden Sie numerische Mathematiksoftware Kalkulationsmethoden, Self-Organizing Maps. 2. das 3D-Bild zu rekonstruieren. Hinweis: Für Testzwecke, ist ein Beispiel-Dataset im Github Repository (siehe oben) zur Verfügung gestellt. Starten Sie die 3D-Rekonstruktion Software und öffnen Sie die 3D Bilddaten. Erstellen einer 3D-Oberfläche (alle) Objekte. Wählen Sie die Option 3D Ansicht , und klicken Sie auf Oberflächen. Klicken Sie auf die nächste (blauer Kreis mit einem weißen Dreieck) mit dem DGM-Erstellung-Assistenten fortfahren. Wählen Sie den Bildkanal für die Flächenrückführung. Wendet eine glättende Funktion zur Vermeidung von porösen Oberflächen. Wählen Sie die Glättung Wert verbirgt nicht die Details der Oberfläche aber vermeidet poröse Oberflächen. Wählen Sie eine Schnittstellenüberwachung, die Oberflächen zu finden. Verwenden Sie einen Schwellenwert für die absolute Intensität, wenn die Objekte gut vom Hintergrund getrennt sind und verfügen über eine etwa gleichmäßige Helligkeit. Gelten Sie eine lokaler Kontrast Schwelle, wenn die Objekte in ihrer Intensität variieren aber noch getrennt werden können, von den lokalen Hintergrund und von den anderen Objekten, die sie umgibt. Festlegen Sie die lokalen Schwelle Suchbereich entsprechend dem Wert des erwarteten Durchmessers der rekonstruierte Objekte. Filtern Sie die rekonstruierten Flächen nach morphologischen Parameter von Interesse, z. B. Lautstärke, Sphärizität, Oberflächen-Volumen-Verhältnis, etc., und beenden Sie die Flächenrückführung. Speichern und Exportieren der erzeugten Oberflächen in einem Format, die mit der 3D Animationssoftware kompatibel ist, die im nächsten Schritt verwendet werden. 3. Transformation der 3D rekonstruiert Flächen in 2D Projektionen Starten Sie Blender und gehen Sie auf die Registerkarte “Ausgabe” im rechten Fenster. Wählen Sie das TIFF-Format im Dropdown-Menü und stellen Sie die Farbtiefe auf 8 Bit RGBA. In Scripting-Modus wechseln und öffnen der bereitgestellten Skript-Datei “GUI_AutoRotate.py” aus dem Repository mit dieser Arbeit (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) zur Verfügung gestellt. Klicken Sie auf Skript ausführen. Wählen Sie den Ordner der Wrl Dateien wenn Sie zur Eingabe aufgefordert werden. Erstellen Sie bei Bedarf weitere Drehungen beim Arbeiten mit komplexer Oberflächen: gehen Sie zu der GUI und Drehungen das Feld auf einen Wert über 6 festgelegt.Hinweis: Eine Drehung der 6 verschiedenen Blickwinkeln kann ausreichen, um die unterschiedlichen Zellpopulationen zu unterscheiden sein. Es empfiehlt sich nicht weniger als sechs Umdrehungen pro Fläche, wegen möglicher Informationsverlust zu schaffen. Führen Sie das Skript, indem Sie auf die Schaltfläche ” Drehen “, in der GUI. Speichern Sie die Projektionen der einzelnen Flächen in den gleichen Ordner, der als input-Ordner (Schritt 2.3) verwendet wurde. Standardmäßig, die Bilder werden gespeichert in einem 8-Bit-Tiff-format (siehe Punkt 2.1), das ist das Format von Fidschi Plugin Schatten erforderlich. 4. finden Sie die Peripherie und berechnen der Fourier-Komponenten mit Fidschi. Öffnen Sie Fidschi und wählen Sie Schatten in das Plugins-Menü aus. Mit den Standardwerten beginnen und später die Parameter optimieren. Klicken Sie auf “OK” wenn Sie bereit sind, das Programm auszuführen. Wählen Sie einen Farbverlauf Schwellenwert für die Schwellwerte für das Ausgangsbild. Wählen Sie die Anzahl der Iterationen. Je größer die Anzahl der Iterationen , desto präziser die Rekonstruktion der Peripherie. Für einfachere Formen ist eine geringere Anzahl in der Regel ausreichend. Verwenden Sie den Anzahl der Dilatationen Parameter, um festzustellen, wie viel größer die Start-Maske im Vergleich zu der aktuellen Zelle. In der Regel brauchen komplexere Formen mehr Dilatation Schritte für richtige Peripherie zu finden. Kontrollkästchen Sie auf Dunklem Hintergrund , wenn die projizierten Formen heller als der Hintergrund sind. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen ” Zeigen Zwischenergebnisse ” nur bei einem kleinen Test-Dataset zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Schatten. Aktivieren diese Option für größere Datasets senkt die rechnerische Effizienz und könnte möglicherweise ein System mit niedrigen Videospeicher zu stoppen. Das Kontrollkästchen Sie Ergebnis-Tabellen zu speichern um die Ergebnisse der Schatten als Eingabe für Schritt 5 zu verwenden. Wenn das Kontrollkästchen aktiviert ist, werden alle Ergebnisse im einzelnen Csv-Dateien gespeichert. Eine Übersicht über die Ausgabe von Daten wird immer in einer Datei namens “Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv” generiert. Wählen Sie den input-Daten-Ordner, der die TIFF-Dateien enthält, die in Schritt 3 erstellt wurden. Liefern Sie der Ausgabeordner Daten. Klicken Sie auf “OK” , um das Plugin zu starten. (5) Self-Organizing Maps Hinweis: SOM Netzwerke sind nur in der Lage, Daten zu klassifizieren, wenn sie auf einem großen Dataset ausgebildet werden, die Eingabe von allen erwarteten Zelltypen und Bedingungen enthält. Zu Demonstrationszwecken solch ein Dataset wird zur Verfügung gestellt und finden Sie in unserem Repository (“AllCells_summary_normalised.csv” von https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis Folgen Sie diesen Richtlinien, wenn keine ausgebildeten SOM steht noch für die Eingabedaten; fahren Sie andernfalls mit Schritt 5.2. Starten Sie einen rechnerischen mathematischen Software in der Lage, neuronale Netzwerk Klassifikationen. Wählen Sie eine Datendatei für die Ausbildung der SOM-Netzwerk verwendet werden. Dieses Dataset sollten alle experimentellen Bedingungen um die SOM auf bestimmte Zelltypen zu trainieren und experimentellen Bedingungen enthalten.Hinweis: Es ist auch möglich, die zur Verfügung gestellten AllCells_summary_normalised.csv zu verwenden, für das System testen. Starten Sie das Training und warten Sie, bis die Ausbildung, bevor Sie fortfahren abgeschlossen ist. Das Skript ist standardmäßig 2000 Iterationen (“Epochen”) ausgeführt.Hinweis: Die Anzahl der Wiederholungen hängt die Lernrate von SOM Abhängig von der input-Daten empfiehlt es sich, höhere und niedrigere Anzahl Epochen testen und beobachten die Stabilität des Musters der Som Wenn Sie das Skript verwenden, kann die Anzahl der Iterationen unter Zeile 32 geändert werden. Die Größe des Netzwerks kann in Zeile 34 (standardmäßig eingestellten bis 12 von 12) geändert werden. Nachdem die Ausbildung abgeschlossen ist, prüfen Sie die Netzwerktopologie (Nachbar Entfernungen, Eingang Flugzeuge, Probe Hits, etc.). Das Netzwerk ist jetzt ausgebildet und kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Bei Verwendung eine bereits ausgebildete Karte (Dies kann Schritt 5.1 oder aus anderen Quellen kommen) um ein Dataset cluster in der SOM laden. Importieren der Csv-Datei, die mit vorinstallierten ausgebildete som getestet werden soll Wählen Sie die Csv-Ausgabe des Schatten-Plugins aus Schritt 4, wenn Daten vorbereitet durch das Schatten-Plugin verwenden.Hinweis: Es ist auch möglich, die Beispiel-Daten-Dateien “InteractingCells_summary_normalised.csv”, “MobileCells_summary_normalised.csv” oder “PhagocytosingCells_summary_normalised.csv” zu verwenden, die über Github bereitgestellt werden. Nachdem die Klassifizierung abgeschlossen ist, Werten Sie die Ergebnisse der SOM wie in Schritt 5.1.5. Untersuchen Sie die Hitmap aus der CSV-Datei erzeugt. Jede Zelle der Karte angezeigt, wie oft das Dataset “hits”, dass bestimmte Zelle von ausgebildeten Som Wenn eine Gruppe von Zellen werden in einem kleinen Gebiet dieser Karte zusammengefasst, bedeutet dies, dass das Dataset ziemlich homogen ist. Mehrere Cluster werden zeigen, dass wahrscheinlich Untergruppen im Dataset vorhanden. Die Nachbarschaft Gewicht Abstände zu untersuchen. Bereiche der Karte, die sind gut getrennt, entsprechen Gruppen von Objekten, die aus Sicht der SOM sehr unterschiedlich Verhalten. Mit DFT-Komponenten als Eingabedaten bedeutet dies, dass diese Zelle Gruppen sehr unterschiedliche Formen der entsprechenden 3D Oberflächen haben. Untersuchen Sie Gewicht Ebenen von Informationen über den Beitrag, indem Sie jedes Element des Vektors Feature. Bei der Verwendung von 20 DFT-Komponenten wie oben beschrieben, erscheinen 19 Karten hier. Wenn Sie die mitgelieferten Beispiel-Dataset zu verwenden, die ersten 5 oder 6 Flugzeuge Gewicht werden anders sein, aber der Rest von ihnen erscheint ziemlich ähnlich. In diesem Fall kann geschlossen werden, dass es genügen würde, etwa 7 DFT-Komponenten verwenden.

Representative Results

Wir angewendet eine DFT um die Hauptkomponenten der Form entspricht der Zelle Projektionen zu berechnen. Die Fourier-Deskriptoren wurden erzielt durch die Anwendung des DFT-Algorithmus auf die Xy-Koordinate Paare der angepasste Peripherie der Zelle Projektionen, als der Ausgang des AbSnake Teils von unseren Workflow erhalten. Diese Xycoordinate-Paare können als kompliziert-bewertet 2D Vektor “g” behandelt werden: Aus dem Vektor “g” verwenden wir DFT um zu kompliziert-bewertet Fourier-Spektrum zu berechnen:Basierend auf bekannten Formeln die diskrete Fourier-Spektrum, und die komplexe Zahl Kennzeichnung “g” als:Wir erhalten:(1)Berechnen wir die Real (“A”) und imaginären (“B”) Komponenten von :(2)(3)Dabei entspricht die erste DFT Komponente G0 m = 0, verleiht:(4)(5)Infolgedessen wird diese Komponente die geometrische Mitte des ursprünglichen Objekts beschrieben.Das zweite Element des DFT vorwärts Spektrums, G1, entspricht m = 1:(6) Von Eq.6 schließen wir, dass diese Punkte einen Kreis mit einem Radius von bilden und Startwinkel , wo der Kreis eine volle Umdrehung beschreibt, während die Form einmal verfolgt wird. Die Mitte des Kreises befindet sich am Ursprung (0, 0), der Radius ist | G1| und Ausgangspunkt ist: (7) In der Regel für einen einzigen Fourier-Koeffizienten , die Koordinaten werden beschrieben als: (8) In ähnlicher Weise, Eq.6, Eq.8 auch beschreibt einen Kreis, aber mit einem Radius von R-m= | Gm|, ein Startwinkel und Ausgangspunkt bei , wo die Kontur einmal verfolgt wird, während “m” volle Bahnen16,17des Kreises durchzieht. Formparameter als SOM-EingabeDer Workflow wie in Abbildung 1beschrieben wurde, eine deconvolved (mit einer gemessenen Punktfunktion verbreiten) angewendet intravitalen Multi-Photonen-Mikroskopie Dataset Mikroglia-Zellen ihre morphologischen Veränderungen im gesunden oder Krebs kortikalen zu charakterisieren Gewebe-18. Zwanzig DFT-Komponenten wurden für jedes 2D Projektion der rekonstruierten 3D Flächen berechnet und die Ergebnisse dienten als Eingabe für das SOM-Training. Unter physiologischen Bedingungen die Mikroglia präsentiert eine ziemlich komplexe Form mit mehreren, stark verzweigte Prozesse (Abbildung 2a). Wenn in einer krebsartigen Umgebung (kortikalen Tumor-Modell), die Mikroglia geändert, um eine einfachere, Spindel-ähnlicher Form (Abbildung 2 b) platziert. Die ausgebildete SOM wurde getestet, um seine Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen gesunden und Krebszellen zu bewerten. Die gesunde Zellenbevölkerung wurde auf einen einheitlichen Raum der SOM (Abbildung 2 c) projiziert. Die SOM reagierte auf die krebsartigen Mikroglia Dataset mit einer Hantel-förmige aktiven Region (Abb. 2d). Ein Blind gemischte Eingabedataset, die DFT Form Komponenten aus der gesunden und der Krebs-Gruppe bestand wurde in zwei verschiedene Gruppen von den SOM projiziert, Unterrichtung die Form ihre individuellen Konturen ähnlich denen der getrennten Gruppen ( Abbildung 2e; Vergleichen Sie mit 2 c und 2d). Daraus kann geschlossen werden, dass die gemischte Dataset erfolgreich durch som gruppierten wurde Wir testeten die Leistung der SOM durch den Vergleich ihrer Prognosen mit der manuellen Analyse derselben Daten durch einen medizinischen Experten, der das Dataset basiert auf ihrem räumlich-zeitliche Verhalten eingestuft. Der Experte identifiziert vier verschiedene Zellgruppen (ruhende Zellen, phagocytosing Zellen, interagierenden Zellen und mobile Zellen18), die rekonstruiert und eingesetzt, um ein 12 x 12 Schulen wurden Som Die ausgebildeten Netzwerk (Abbildung 3a) zeigt Gruppen von hohe Hit-Wert künstliche Neuronen, vor allem in der linken unteren und mittleren Bereich des Som Die Antwort des geschulten Netzwerks wurde auch getestet, mit vier zufällig ausgewählte Teilmengen (die nicht Teil des Training-Datasets) von Bildern aus den vier verschiedenen Gruppen von Experten18identifiziert. Diese Bild-Teilmengen führte vier klar definierte Antworten von SOM, wie in Abbildung 3 bgezeigt. Ruhende Zellen weisen die komplexeste Form und zeigte die höchste Trennung innerhalb des neuronalen Netzes (Abb. 3 b “ruhenden” Panel). Die anderen drei identifizierte Zelltypen einen gemeinsamen Raum der SOM in der unteren linken Ecke geteilt, aber ansonsten von SOM getrennt wurden Die untere linke Ecke SOM Bereich entspricht somit der unteren DFT-Indexwerte. Die Robustheit des SOM-Ansatzes wurde getestet, indem die geschulten SOM mit drei zufällige Teilmengen desselben – Ruhe – Zelltyp (nicht Teil des Training-Datasets). Die Reaktion der SOM auf diesen Eingang weist eine sehr ähnliche Reaktion (Abbildung 3 c, Teilmengen 1-3), demonstriert die Robustheit unseres Ansatzes. Zeitabhängige Zellenveränderungen Form zeichnen sich genau durch DFTUm die Wirkung von zeitabhängigen Veränderungen der Zelle Form auf die DFT-Komponenten zu untersuchen, wurden ein bis drei Zellen pro Untergruppe (siehe Abb. 3 b) für 13 bis 28 Zeitpunkte verfolgt. Abbildung 4 zeigt die ersten zehn DFT Komponenten einer mobile Zelle (Abb. 4a) und einer interagierenden Zelle (Abbildung 4 b), die als Funktion der Zeit dargestellt wurden. Die mobile Zelle weist eine dauerhaft verändern Form (siehe ergänzende Video 4 in 8), die durch eine rauere DFT-Oberfläche reflektiert wird. Die Ausbrüche von DFT Amplitude im ersten Drittel von den zeitlichen Verlauf der interagierenden Zelle zusammenfallen mit der schnelle und große Zelle Formveränderungen wie ergänzende Video 5 in 8gezeigt. Der zeitlichen Verlauf aller 19 DFT Komponenten zeichnete sich auch für diese beiden Zellen zu drei getrennten Zeitpunkten während der Verfolgung einer mobilen Zelle (Abb. 5a) und einer interagierenden Zelle (Abb. 5 b). Die senkrechten Achsen hiermit die sechs Drehwinkel dar, die darauf hinweisen, dass alle Projektionen ebenso wichtig für die Charakterisierung der Form für beide Zelltypen sind. Abbildung 1: Schritt für Schritt Workflow der Datenverarbeitung Zelle clustering identifizieren anhand der Form der Zellen. Oberflächen in 3D rekonstruiert wurden als Eingabe für Blender für automatisierte 3D auf 2D Projektionen verwendet. Die Peripherie der einzelnen Projektionen befand und die DFT-Komponenten wurden berechnet. Die Komponenten diente als Eingang entweder eine ausgebildete SOM in Matlab oder einer neuen som zu trainieren Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Typisches Erscheinungsbild der kortikalen Mikroglia Mauszellen unter Kontrolle Bedingungen (a) und in Krebsgewebe (b) Screenshots von rekonstruierten Mikroglia Oberflächen. SOM Projektionen entstanden aus den drei Gruppen der Mikroglia Proben aus der Maus Kortex: (nicht-tumoröse) Zellen (c), Tumorzellen (d) und eine gemischte Population von Zellen (e) steuern. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3. (a, links) Selbstorganisierende Karte eines Maus-Mikroglia-Datasets bestehend aus 768 Eingabe-Feature-Vektoren. Der Datensatz wurde verwendet, um ein 12 x 12 künstliches neuronales Netz, mit Geometrie sechseckigen Nachbarschaft, zufällige Initialisierung und 2000 Epochen zu trainieren. (a, rechts) Die entsprechenden SOM Eingang Flugzeuge der ersten 10 DFT Komponenten (b) die Antworten der SOM dargestellt unter (a), um eine zufällige VRML Datei Teilmenge jeder von den vier Zelltypen “mobile”, “Interaktion”, “ruhenden” und “phagocytic” als erste beschrieben in Abbildung 5 Bayerl Et al. 18. (c) die Antwort von der gleichen SOM wie in (a, links) auf drei zufällige Teilmengen des gesamten Datasets (die also nicht Teil des Training-Datasets wurden) von der “ruhende Zellen”-3D Oberflächen geben. Die Ähnlichkeit zwischen den drei Antworten ist bemerkenswert. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4. (a) Zeitabhängigkeit der ersten 10 DFT Komponenten während einer intravitalen imaging Experiment der Maus Mikroglia. Dieses Panel zeigt Daten für eine Zelle des Typs “Mobile Zellen”. Die x-Achse entspricht Zeitpunkten des Experiments bei 60 s Zeitauflösung, die y-Achse zeigt die Amplitude der DFT Komponenten in beliebigen Einheiten (AE), während die z-Achse der DFT-Komponente von 1 bis 10 entspricht. (b) wie in (a), aber für eine Zelle der “Interaktion Zellen” geben. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5. (a) das Verhalten von allen 19 DFT Bestandteile einer Zelle des Typs “Mobile Zellen” am Anfang, in der Mitte und am Ende des Experiments. Die Zahlen auf der x-Achse entsprechen die DFT Komponenten-ID 1 bis 19. Die y-Achse zeigt die DFT-Komponente-Amplitude in beliebigen Einheiten (AE), während die Z-Achse markiert die sechs zufällige Drehwinkeln. (b) das gleiche wie in (a), aber für eine Zelle der “Interaktion Zellen” geben. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die Identifizierung von möglicherweise pathologischen Zuständen, die mit kleinen, intakte Gewebeproben ist von hoher Bedeutung. Solche Techniken gewährleistet eine zeitnahe Reaktion auf Infektionskrankheiten und aggressiven Krebsarten. Die kinetische und morphologischen Reaktionen verschiedener Immunzellen, z. B. Mikroglia und Makrophagen, sind charakteristisch für die Immunantwort des Körpers. Obwohl in den meisten Fällen nicht sinnvoll oder sogar möglich, das kinetische Verhalten dieser Zellen zu überwachen ist, ist es relativ einfach, 3-dimensionale Bilder abrufen ihrer Form zu erwerben. In der Regel übernehmen die Immunzellen eine komplexe Form in gesundes Gewebe und eine viel einfachere Form unter entzündeten oder Krebs Bedingungen18. Während unser Verständnis für die Entwicklung der Immunantwort die zeitabhängige Eigenschaften solcher Formänderung verleihen würden, kann nur die 3D Form einer repräsentativen Gruppe von Zellen auch ausreichen, um die gesunde oder pathologischer Natur bestimmen sein des Gewebes.

Charakterisierung der 3-dimensionale Oberfläche einer Zelle ist keine einfache Aufgabe. Die Anwendung von sphärischen Harmonien ist eine Möglichkeit zur Darstellung einer 3D-Oberfläche mit einer relativ großen Anzahl (50-70) von Komponenten11,12. Darüber hinaus ist die Bestimmung der kugelförmige Harmonik rechnerisch teuer; sehr komplexe Formen auf der Einheitskugel zu projizieren, ist entweder unmöglich oder sehr schwierig wegen der Notwendigkeit, mehrere Netze verschiedener Feinheit auf der Einheitskugel anzuwenden; Schließlich ist die sinnvolle Interpretation der Spektren der kugelförmigen harmonischen Komponenten alles andere als trivial.

In unserer hier vorgestellten Arbeit ersetzen wir die schwierige Aufgabe der direkten 3D Oberflächenanalyse mit dem viel einfacher Ansatz der Verwendung von 2D Projektionen der ursprünglichen Fläche ausreichend morphologische Informationen zum pathologische Bedingungen identifizieren zu gewinnen. Wir bewiesen jeden Schritt dieses Workflows mithilfe von 3D Mikroskopie Daten aus myeloischen Zellen, während deutlich hingewiesen, dass alle Schritte waren einfach zu vervollständigen und die daraus resultierende 2-dimensionale Karten waren einfach zu interpretieren.

Natürlich wird eine 3D-2D Projektion zu Verlust von Informationen über die Struktur der Oberfläche führen. In unserem Beispiel-Dataset der Mikroglia in einem Mausmodell der kortikalen Tumor reichte es sechs Winkel verwenden, wenn die 2D Projektionen zu erstellen. Jedoch erfordern komplexere Formen oder weniger bekannten morphologische Veränderungen, dass eine größere Anzahl von Projektionen erstellt werden, um die Zelle Untergruppen mit som zuverlässig identifizieren zu können Aus diesem Grund soll unser Ansatz in der Lage zur Erzeugung und Analyse einer beliebigen Anzahl von Projektionen. Einfach durch die Wahl einer höheren Anzahl von Projektionen für komplexere Formen, ist es möglich, den Datenverlust auf ein erträgliches Minimum zu skalieren. Als Beispiel würde der interagierenden Zelltyp in Abb. 4a und 4 b eine größere Anzahl von Projektionen benötigen, um komplexe Oberfläche richtig darzustellen.

Als eine Näherungsmethode musste der hiermit vorgeschlagene Workflow gegen die Ergebnisse der manuellen Klassifizierungsprozess Mikroglia18getestet werden. Zuvor präsentierten Ergebnisse bestätigt die Zuverlässigkeit des automatisierten Workflows. Darüber hinaus ist der Workflow effizienter im Vergleich zu herkömmlichen Analyse. Die medizinischen Sachverständigen, die die Mikroglia-Zellen manuell klassifiziert benötigt ca. 4 Wochen für seine Analyse des Datasets, während unseren Workflow nur etwa 1 Tag benötigt. Die Robustheit unserer Herangehensweise erwies sich auch deutlich durch die Reproduzierbarkeit der ausgebildeten SOM auf eine Teilmenge der Daten, die gehörte zu den gleichen Typ, aber wurde nicht verwendet, um die SOM, wie in Abbildung 3 czeigen zu trainieren.

Obwohl unser Ansatz nicht kinetische Informationen hielt, haben wir untersucht die Wirkung des Timings der DFT-basierten Form-Analyse. Das typischste Beispiel für zeitabhängige Verhalten wurde der mobile Zelle Bevölkerung gefunden wo war der Beitrag von den höheren indizierten DFT Komponenten deutlich zu beobachten, wie in Abbildung 4a. Dies lenkt die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung der Nutzung einer genug hohen Anzahl von DFT Komponenten beim Umgang mit Zelltypen, die voraussichtlich sehr zeitabhängige Verhalten. Aufgrund der automatisierten Natur und hohe Ausführungsgeschwindigkeit von unseren Software-Tools erhöht die gestiegene Zahl der DFT Komponenten und Projektionen die Präzision und Zuverlässigkeit der Ergebnisse, während sie die Rechenleistung nicht erheblich behindern werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Benjamin Krause für die fruchtbare Diskussion und seine Unterstützung. Die Autoren weiter danken Robert Günther für seine Unterstützung bei der live Zelle Mikroskopie.

Die Arbeit wurde unterstützt durch die DFG finanzielle Unterstützung NI1167/3-1 (JIMI), R.N und Z.C., DFG finanzielle Unterstützung CRC-1278 PolyTarget Projekt Z01 für Z.C., C01 in TRR130 R.N und SFB633, TRR130, Exc257, A.E.H. und J.B.S. Das BfR unterstützte intramuralen SFP1322-642 F.L.K und A.L.

Materials

Imaris 9.1.2, software Bitplane, Zürich, Switzerland v.9.1.2 3D image reconstruction and surface generation; this was used by us!
Blender 2.75a, software https://www.blender.org/ v.2.75a 3D and 4D open source animation software; 2.75a is the required version for this Python
Fiji /ImageJ, software https://fiji.sc/ ImageJ v.1.52b Open source multi-D image analysis toolkit
MATLAB MathWorks, www.mathworks.com R2017b General computational mathematical software
MATLAB Machine Learning kit MathWorks, www.mathworks.com R2017b Can only be used together with MATLAB
Fiji plugins: SHADE https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis v.1.0
Fiji plugins: ActiveContour http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start absnake2
Computer Any NA See Imaris instructions for minimum computer requirements
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References

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Kriegel, F. L., Köhler, R., Bayat-Sarmadi, J., Bayerl, S., Hauser, A. E., Niesner, R., Luch, A., Cseresnyes, Z. Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps. J. Vis. Exp. (140), e58543, doi:10.3791/58543 (2018).
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