健康と病理の間の区別の形態に基づく細胞利用のフーリエ変換と自己組織化マップ

1. プロトコルの要件 サンプリング間隔高解像度画像を得るための試験片の少なくとも 2 回最高の空間周波数とナイキスト基準に準拠して逆算高分解能逆算三次元 (3 D) 顕微鏡データを取得します。 表面再構成とエクスポートは、3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。 Python スクリプトを実行することができる 3 D アニメーション ソフトウェアを使用 (Python スクリプトは github のレポジトリからダウンロードすることができます: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) 2 D 投影を作成します。 フィジー13を使用して投影を分析し、DFT 成分を抽出します。 現在のフィジー配布を使用します。フィジーのインストール済みのバージョンが既にある場合は、インストールされているバージョンが最新であることを確認します。これは簡単にヘルプを実行して実現できます |更新オプションです。 を使用して動的輪郭プラグイン15、http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start からダウンロードすることができますし、プラグインのフォルダーにコピーする必要があります。 Github のレポジトリ、プラグインのフォルダーにコピーから陰フィジー プラグインをダウンロードします。 自己組織化マップの計算できる計算数学ソフトウェアを使用します。 2. 3 D 画像を再構成します。 注: テスト目的のため、例のデータセットは、github のリポジトリ (上記参照) で提供されます。 三次元ソフトウェアを起動し、3 D 画像データを開きます。 (すべて) オブジェクトの 3D サーフェスを作成します。 表面の3 D 表示オプションを選択クリックします。サーフェスの作成ウィザードを続行する (白い三角形の付いた青い円)、次のボタンをクリックします。 表面再構成のための画像チャネルを選択します。 多孔性の表面を避けるために平滑化関数を適用します。 表面の詳細を隠していないが、多孔性の表面を回避するスムージングの値を選択します。 表面を見つけようしきい値選定法を選択します。 オブジェクトを背景から十分に分離し、およそ均一の明るさレベルを持っている場合は、絶対強度しきい値を使用します。 オブジェクトはその強度は異なりますが、まだローカルの背景から、それらを取り巻く他のオブジェクトから分離できる場合は、ローカル コントラストを適用されます。再建されたオブジェクトの期待される直径の値に従ってローカルしきい値検索領域を設定します。 関心、ボリュームなど、真球度、表面・体積比などの形態学的パラメーターに従って再建された表面にフィルターを適用し、表面再構成を終了します。 保存し、次のステップで使用される 3 D アニメーション ソフトウェアと互換性のある形式で生成されたサーフェスをエクスポートします。 3. 変換 3 D 2D プロジェクションにサーフェスを再構築 ミキサーを起動し、右側のウィンドウで、[出力] タブに移動します。ドロップ ダウン メニューから TIFF 形式を選択し、色深度を 8 ビット RGBA に設定します。 スクリプト モードに切り替わり、この作品 (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis) で提供されるリポジトリから提供されているスクリプト ファイル”GUI_AutoRotate.py”を開きます。 スクリプトを実行するをクリックします。入力を求められたら wrl ファイルのフォルダーを選択します。 必要な場合より複雑なサーフェスを使用するときより多くの回転を作成: GUIに移動し、回転ボックス 6 を超える値に設定します。注: 6 さまざまな角度の回転は、異なる細胞集団を区別するために十分なすることができます。潜在的な情報損失のため表面あたり六つ以下の回転を作成することはお勧めしません。 スクリプトを実行するには、GUI の回転ボタンをクリックします。個々 のサーフェスの投影を入力フォルダー (手順 2.3) として使用された同じフォルダーに保存します。既定では、画像は 8 ビット Tiff で保存されます。 書式設定 (手順 2.1 参照)、フィジー プラグイン日陰で必要な形式であります。 4. 周囲を見つけるし、フィジーを使用してフーリエを求めよ。 フィジーを開き、プラグイン メニューでシェードを選択します。既定値を持つを開始し、後にパラメーターを微調整します。[Ok]プログラムを実行する準備ができたらクリックします。 入力画像の閾値のグラデーションのしきい値を選択します。 反復計算の回数を選択します。イテレーションの数の値を大きくより正確な周囲の再建。単純な形状より低い数で通常十分です。 膨張数パラメーターを使用して、決定どのくらい大きい開始のマスクは、実際のセルと比較されます。通常より複雑な図形は、適切な周囲を見つけるのための拡張手順を必要があります。 投影図形がバック グラウンドよりも明るい場合、暗い背景をチェックします。 日陰のパフォーマンスを確認する小テスト データセットを使用する場合のみ、中間結果の表示]チェック ボックスを有効にします。大きなデータセットに対してこのオプションをアクティブにする計算の効率を下げるし、ビデオ メモリの少ないシステムを停止できる可能性があります。 ステップ 5 で入力として日陰の結果を使用するには、[結果テーブルを保存] チェック ボックスをオンに。このオプションをオンにすると、すべての結果が個々 の csv ファイルで保存されます。出力データの要約は、常に”Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv”というファイルに生成されます。 手順 3 で作成された TIFF ファイルを含む入力データ フォルダーを選択します。 出力データのフォルダーを提供します。 プラグインを起動する[ok]をクリックします。 5 自己組織化マップ 注: SOM ネットワークでは、彼らはすべての予想される細胞の種類や条件からの入力が含まれている大規模なデータセットに訓練されるときデータを分類するだけです。デモンストレーションの目的についてこのようなデータセットが提供され、リポジトリ (“AllCells_summary_normalised.csv”https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis からで見つけることができます。 訓練された SOM がない場合これらのガイドラインに従ってください、まだ入力データそれ以外の場合 5.2 の手順に進みます。 ニューラル ネットワークの分類を行うことができる計算の数学ソフトウェアを起動します。 SOM ネットワークを訓練するために使用するデータ ファイルを選択します。このデータセットは、すべての特定のセルタイプに SOM を訓練するために実験条件、実験条件を含める必要があります。注: システムをテストするため提供されている AllCells_summary_normalised.csv を使用することが可能ですも。 トレーニングを開始し、続行する前に、トレーニングを完了するまで待ちます。既定では、スクリプトは 2000 のイテレーション (「エポック」) の実行に設定されます。注: 反復回数 SOM の学習速度によって異なります入力データに応じてそれは新紀元の上位と下位の両方の数をテスト SOM のパターンの安定性を確認することをお勧め用意されているスクリプトを使用している場合は、ライン 32 の下で反復計算の回数を変更できます。(既定では 12 を 12 に設定すると) 34 行ネットワークのサイズを変更できます。 トレーニングを終了すると、ネットワークのトポロジ(隣人の距離、入力面、サンプル ヒット等)を調べる。ネットワークは、今訓練されており、将来使用するため保存することができます。 データセットをクラスター化するに (これは、ステップ 5.1 または他のソースから来ることができる) すでに訓練されたマップを使用する場合、SOM のロードします。 プリロードされた訓練された SOM を使用してテストは、csv ファイルをインポートします。日陰プラグインが作成したデータを使用する場合、手順 4 から陰プラグインの csv 出力を選択します。注: それはまた github経由で提供されるサンプル データ ファイル”InteractingCells_summary_normalised.csv”、”MobileCells_summary_normalised.csv”または”PhagocytosingCells_summary_normalised.csv”を使用することが可能。 分類が終了した後は、手順 5.1.5 と SOM の結果を評価します。 Csv ファイルから生成されたを確認します。各マップのセル表示回数データセット「ヒット」訓練された SOM の特定のセルこのマップの小さな領域では、セルのグループがクラスター化されて、これはデータセットが均質であることを示します。サブグループの可能性が高いがデータセット内に存在する複数のクラスターを示します。 近所の体重の距離を調べます。よく分かれているこのマップのエリアは、非常に別様に SOM の観点からオブジェクトのグループに対応しています。DFT コンポーネントを入力データとして、これは対応する 3 D 表面の非常に異なる形状があるこれらの細胞集団を意味します。 特徴ベクトルの各要素の貢献について重量面を確認します。前述のように 20 の DFT コンポーネントを使用する場合 19 マップがここに表示されます。提供例のデータセットを使用して、最初の 5 または 6 の重量面は別になりますが、それらの残りの部分はかなりに似て表示されます。この場合約 7 DFT コンポーネントを使用するのに十分にあろうと判断できます。