Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunohistochemistry è una tecnica per la rilevazione di componenti del tessuto con l’uso di anticorpi contro specifiche molecole cellulari e successive tecniche di colorazione per rilevare gli anticorpi coniugati¹. Questa procedura di immunohistochemical richiede particolare attenzione e il trattamento dei tessuti che sono spesso empiricamente determinati per l’antigene specifico, dei tessuti e l’anticorpo utilizzato². La fissazione è cruciale per mantenere lo stato “originale” del tessuto e quindi mantenendo intatto cellular e strutture subcellulari e modelli di espressione. Ulteriore elaborazione e incorporare procedure necessari per preparare il tessuto per il taglio a fettine sottili che vengono utilizzati per gli studi istologici che coinvolgono immunohistochemistry.

Immunostaining può essere eseguita con rilevamento o cromogenico o fluorescente. Cromogenico rilevamento richiede l’utilizzo di un enzima per convertire un substrato solubile in un prodotto colorato insolubile. Mentre questo enzima può essere coniugato all’anticorpo riconosce l’antigene (anticorpo primario), esso è più spesso coniugata con l’anticorpo che riconosce l’anticorpo primario (cioè, l’anticorpo secondario). Questa tecnica è altamente sensibile; il prodotto colorato risultante dalla reazione enzimatica è fotostabile e richiede solo un microscopio a campo chiaro per l’imaging. Tuttavia, cromogenico immunostaining può non essere adatto quando si tenta di visualizzare due proteine che co-localizzano, poiché la deposizione di un colore può mascherare la deposizione di altro. In caso di co-macchiatura, immunofluorescenza ha dimostrato di essere più vantaggioso. L’avvento dell’immunofluorescenza è attribuita a Albert Coons e colleghi, che ha sviluppato un sistema per identificare gli antigeni del tessuto con anticorpi marcati con fluoresceina e visualizzarli nei tessuti sezionati sotto luce ultravioletta³. Rilevazione della fluorescenza è basato su un anticorpo coniugato con un fluoroforo che emette luce dopo l’eccitazione. Poiché esistono diversi fluorofori con emissioni a lunghezze d’onda (con poca o nessuna sovrapposizione), questo metodo di rilevamento è ideale per gli studi di molte proteine.

Il surrene è un organo accoppiato situato sopra il rene e caratterizzato da due componenti embriologicamente distinte, circondate da una capsula mesenchymal. Corteccia surrenale esterna, derivata dal mesoderma intermedio mesonefrici, secerne ormoni steroidei, mentre il midollo interno, derivato dalla cresta neurale, produce le catecolamine tra cui adrenalina, noradrenalina e dopamina. La corteccia surrenale è istologicamente e funzionalmente suddiviso in tre zone concentriche, con ogni zona che secernono diverse classi di ormoni steroidei: l’esterno zona glomerulare (zG) produce mineralcorticoidi che regolano l’omeostasi dell’elettrolito e volume intravascolare; la centrale zona fascicolata (zF), direttamente sotto il zG, secerne i glucocorticoidi che mediano la risposta allo stress attraverso la mobilitazione delle riserve di energia per aumentare il glucosio del plasma; e i reticularis di zona interna (zR), che sintetizza il sesso precursori steroidei (cioè, del deidroepiandrosterone (DHEAS))⁴.

Qualche variazione nella zonazione corticosurrenale è presente tra le specie: per esempio, Mus musculus manca la zR. X-zone postnatale unica di M. musculus è un residuo della corteccia fetale caratterizzata da piccole cellule lipido-poveri con acidofilico citoplasmi⁵. X-zone scomparirà alla pubertà nei topi maschi e dopo la prima gravidanza nei topi femmina, o gradualmente degenera in femmine di razza non^6,7. Inoltre, la tortuosità e lo spessore delle esposizioni zG segnato variazione tra le specie come organizzazione delle cellule staminali e progenitori periferiche in ed adiacente la zG. Il ratto, a differenza di altri roditori, ha una zona indifferenziata visibile (zU) tra il zG e zF che funzioni come una zona di cellule staminali e/o una zona del transiente amplificando progenitori. Se il zU è unica ai ratti o semplicemente un più prominente organizzato aggregato di cellule è sconosciuto^8,9.

Le cellule della corteccia surrenale contengono goccioline lipidiche contenenti esteri del colesterolo che servono come il precursore di tutti gli ormoni steroidei^10,11.  Il termine “steroidogenesi” definisce il processo di produzione di ormoni steroidei dal colesterolo tramite una serie di reazioni enzimatiche che coinvolgono l’attività del fattore steroidogenico 1 (SF1), la cui espressione è un indicatore del potenziale steroidogenic. Nella ghiandola adrenale, Sf1 espressione è presente solo nelle cellule della corteccia¹². Un interessante studio ha trovato l’espressione di biotina endogena in cellule corticosurrenali con potenziali steroidogenic¹³. Mentre questo può essere la causa di un più elevato background in metodi di colorazione biotina/streptavidina-base, a causa del rilevamento di biotina endogena di anticorpo coniugato con streptavidina, questa caratteristica potrebbe essere impiegata anche per distinguere il steroidogenic cellule da altre popolazioni all’interno della ghiandola surrenale, cioè, endoteliale, capsulare e cellule di midollo.

Innervati dai neuroni preganglionic simpatici, il midollo surrenale è caratterizzato da cellule basophilic con un citoplasma granulare contenente epinefrina e norepinefrina. Cellule di midollo sono denominate “cromaffine” grazie all’elevato contenuto di catecolamine che formano un pigmento marrone dopo ossidazione¹⁴. Tirosina idrossilasi (TH) è l’enzima che catalizza la tappa limitante della sintesi delle catecolamine e, nella ghiandola adrenale, è espresso solo nel midollo¹⁵.

Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento delle ghiandole surrenali di mouse, loro elaborazione per l’incorporamento in paraffina e sezionamento e un metodo per eseguire immunofluorescenza su sezioni adrenale di colorazione al fine di identificare i tipi cellulari che costituiscono il corteccia surrenale e nel midollo. Questo protocollo è uno standard nel nostro laboratorio per immunostaining con gli anticorpi più abitualmente utilizzati nella nostra ricerca.