בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה
Summary
כאן אנו מציגים שיטה כדי לבודד את בלוטת יותרת הכליה של עכברים, לתקן את הרקמות, סעיף אותם ולבצע immunofluorescence מכתים.
Abstract
Immunofluorescence היא טכניקה ומבוססת על גילוי של אנטיגנים ברקמות עם העבודה של נוגדנים fluorochrome מצומדת ויש קשת רחבה של יישומים. זיהוי של אנטיגנים מאפשרת אפיון וזיהוי של סוגי תאים מרובים. ממוקם מעל הכליות, כמוס על ידי שכבה של תאים mesenchymal, בלוטת יותרת הכליה הוא איבר האנדוקרינית הולחן על ידי שני ברקמות שונות עם מקורם embryological שונים, mesonephric ביניים, נגזר והמזודרם בקליפת המוח החיצונית, את עצבי קרסט-derived לשד פנימית. קליפת יותרת הכליה מפרישה סטרואידים (קרי, mineralocorticoids, glucocorticoids, הורמוני המין), ואילו ליבת יותרת הכליה מייצרת catecholamines (קרי, אדרנלין, ונוראדרנלין). בעת ביצוע מחקר בלוטת יותרת הכליה, חשוב להבדיל בין תאים ייחודיים עם פונקציות שונות. כאן אנו מספקים פרוטוקול שפותח במעבדה שלנו המתאר סדרה של שלבים רציפים הנדרש להשגת immunofluorescence מכתים לאפיין את סוגי התאים של בלוטת יותרת הכליה. אנו מתמקדים תחילה הקרע של בלוטות יותרת הכליה העכבר, הסרת שומן periadrenal ואחריו את הקיבעון, עיבוד, פרפין הטבעה של הרקמה מיקרוסקופית. לאחר מכן נתאר חלוקתה של אבני רקמה עם מיקרוטום רוטרי. לבסוף, אנו מפרטים עבור צביעת immunofluorescent של בלוטת יותרת הכליה שרכשנו כדי למזער את איגוד שאינם ספציפיים נוגדנים והן autofluorescence על מנת להשיג אות אופטימלית פרוטוקול.
Introduction
אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה לגילוי הרקמות מרכיבים עם השימוש של נוגדנים ספציפיים מולקולות התאית, טכניקות צביעת הבאים כדי לזהות את הנוגדנים מצומדת1. הליך immunohistochemical דורש קיבוע ספציפיים, עיבוד של רקמות שנקבעות לעיתים קרובות מדעית של אנטיגן ספציפי, רקמות, נוגדן מנוצל2. קיבעון הוא חיוני כדי לשמור על המדינה “מקורי” של הרקמות, ובכך שומר על סלולרי ללא פגע, subcellular מבנים ותבניות ביטוי. בהמשך הטמעת נהלים ועיבוד נדרשים להכין את הרקמה חלוקתה פרוסות דק המשמשים עבור היסטולוגית מחקרים שכללו אימונוהיסטוכימיה.
Immunostaining יכול להתבצע עם זיהוי הדפסות כסף או פלורסנט. זיהוי הדפסות כסף מחייבת הניצול של אנזים להמיר מצע מסיסים מוצר בצבע לא מסיסים. בעוד אנזים זה יכול להיות מצומדת כדי הנוגדן לזהות אנטיגן (נוגדן ראשוני), היא מצומדת לעתים קרובות יותר כדי הנוגדן לזהות נוגדן ראשוני (קרי, הנוגדן משנית). טכניקה זו היא רגישה מאוד; המוצר בצבע הנובע התגובה אנזימטי photostable ודורש רק מיקרוסקופ brightfield עבור הדמיה. עם זאת, immunostaining הדפסות כסף מתאים בהכרח כאשר מנסה להמחיש שני חלבונים לשפה משותפת, מאז בתצהיר של צבע אחד יכול להסוות בתצהיר של האחר. במקרה של שיתוף מכתים, immunofluorescence הוכיחה להיות יותר יתרון. כניסתו של immunofluorescence מיוחס אלברט ירקו ועמיתיו, שפיתח מערכת כדי לזהות אנטיגנים רקמות עם נוגדנים מסומנים fluorescein ותנסו לדמיין את אותם ברקמות משרטוטי תחת אור אולטרה סגול3. קרינה פלואורסצנטית זיהוי מבוסס על נוגדן מצומדת עם fluorophore הפולטת אור לאחר עירור. מכיוון שישנם מספר fluorophores עם פליטת באורכי גל שונים (עם חפיפה אין או הקטנה), שיטה זו זיהוי הינו אידיאלי עבור המחקרים של מספר חלבונים.
בלוטת יותרת הכליה הוא איבר לזווג הממוקם מעל הכליה, המאופיינת על ידי שני מרכיבים נפרדים embryologically מוקף קפסולה mesenchymal. קליפת יותרת הכליה החיצוני, נגזר והמזודרם ביניים, mesonephric מפריש הורמונים סטרואידים בעוד לשד פנימית, נגזר על הרכס העצבי, מייצרת catecholamines כולל אדרנלין ונוראדרנלין, דופמין. קליפת יותרת הכליה בהיסטולוגיה והן מבחינה תפקודית מחולקת לשלושה אזורים קונצנטריים, עם כל אזור מפריש מחלקות שונות של הורמונים סטרואידים: glomerulosa zona החיצוני (zG) מייצרת mineralocorticoids המווסתים הומאוסטזיס אלקטרוליט, קרישה תוך-כלית כרך; fasciculata zona האמצעי (zF), ישירות מתחת zG, מפריש glucocorticoids המתווכות את תגובת המתח דרך הגיוס של מאגרי האנרגיה כדי להגדיל גלוקוז; וסקס reticularis zona הפנימי (zR), אשר משלב מבשרי סטרואידים (קרי, דהידרואפיאנדרוסטרון (DHEAS))4.
גיוון ב- adrenocortical zonation קיים בין המינים: לדוגמה, ס. מאסכאלאס חסרה את zR. ייחודי כמחנכת X-האזור של מסיה musculus הוא שריד של קליפת המוח העוברי מאופיין על ידי תאים קטנים השומנים עלוב עם acidophilic cytoplasms5. אזור X נעלמת בגיל ההתבגרות בעכברים זכרים, לאחר ההריון הראשון בעכברים נקבה, או בהדרגה והגויות ב הנקבות-bred לא6,7. יתר על כן, tortuosity ואת עובי המוצגים zG שסומנו וריאציה בין המינים אינה ארגון של תאי גזע וקדמון היקפיים, סמוך zG. העכברוש, בניגוד מכרסמים אחרים, יש אזור מובחן גלוי (זו) בין zG המיקלע זד אף כי פונקציות כמו אזור תא גזע ו/או אזור של ארעי הגברה אבות. אם זו היא ייחודית חולדות או פשוט יותר מאורגן בצורה בולטת אשכול של תאים הוא לא ידוע8,9.
תאים של קליפת יותרת הכליה מכילים טיפות השומנים המאחסנים אסטרים כולסטרול לשרת כמבשר הורמונים סטרואידים כל10,11. המונח “steroidogenesis” מגדיר את תהליך הייצור של הורמונים סטרואידים מ כולסטרול דרך סדרה של תגובות אנזימטיות המערבות את הפעילות של פקטור שחלת בקר 1 (SF1), אשר הביטוי הוא סמן של פוטנציאל שחלת בקר. בלוטת יותרת הכליה, ביטוי Sf1 קיים רק בתאים של קליפת12. אדם מעניין למצוא הביטוי של ביוטין אנדוגני תאים adrenocortical עם פוטנציאל שחלת בקר13. זה אמנם יכול להיות הגורם של רקע גבוה יותר מבוססות-ביוטין/streptavidin שיטות מוכתמים, עקב הגילוי של ביוטין אנדוגני על ידי נוגדנים מצומדת עם streptavidin, מאפיין זה יכול להיות מועסק גם כדי להבדיל את שחלת בקר תאים של אוכלוסיות אחרות בתוך בלוטת יותרת הכליה, קרי, אנדותל, דרכים, ואת תאי לשד.
Innervated על ידי נוירונים preganglionic אוהדת ליבת יותרת הכליה מאופיין על ידי תאים basophilic עם ציטופלזמה פרטנית המכיל אפינפרין ונוראפינפרין. לשד תאים נקראים “chromaffin” בשל תכולה גבוהה של catecholamines בצורת פיגמנט חום לאחר חמצון14. טירוזין hydroxylase (ה) הוא האנזים מזרז את הצעד הגבלת קצב הסינתזה של catecholamines ו, ב בלוטת יותרת הכליה, מתבטאת רק לשד ה-15.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של העכבר בלוטת יותרת הכליה, עיבודם להטבעת פרפין, חלוקתה, ואת שיטה לבצע immunofluorescence מכתים במקטעי האדרנל כדי לזהות את סוגי הסלולר המהוות קליפת יותרת הכליה ואת לשד. פרוטוקול זה הוא תקן במעבדה שלנו עבור immunostaining עם מספר נוגדנים בשימוש שגרתי במחקר שלנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה בידודו של העכבר יותרת הכליה יחד עם ההכנה, צביעה של העכבר פרפין-מוטבע משרטוטי האדרנלים.
לעומת פרוטוקולים אחרים שבדקנו, פרוטוקול immunofluorescence זה הוכיח מתאים עבור הרוב המכריע של נוגדנים בשימוש המעבדה שלנו. עם זאת, במקרים מסוימים זה עשוי לדרוש כמה התאמות כדי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר פרהיוט אבבה זובייר על ההערות המועילות שלו וסיוע טכני בהקמה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה, נבחרת מוסדות של הבריאות מחקר גרנט 2R01-DK062027 (ל G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
