Isolation, Fixation et l’Immunofluorescence imagerie des glandes surrénales de souris

Immunohistochemistry est une technique de détection de composants tissulaires avec l’utilisation d’anticorps dirigés contre des molécules cellulaires spécifiques et des techniques de coloration ultérieures pour détecter les anticorps conjugués¹. Cette procédure d’immunohistochemical nécessite une fixation spécifique et traitement des tissus qui sont souvent empiriquement déterminées pour l’antigène spécifique, les tissus et les anticorps utilisés². La fixation est essentielle préserver l’état « original » du tissu et ainsi maintenir intact cellulaires et des structures subcellulaires et profils d’expression. Plus de traitement et d’incorporation des procédures sont tenus de préparer le tissu pour la coupe en tranches fines qui sont utilisés pour les études histologiques concernant l’immunohistochimie.

Immunomarquage peut être effectuée avec détection chromogénique ou fluorescente. Détection chromogénique nécessite l’utilisation d’une enzyme pour convertir un substrat soluble en un produit coloré insoluble. Alors que cette enzyme peut se conjuguer à l’anticorps reconnaissant l’antigène (anticorps primaire), il est plus souvent conjugué à l’anticorps reconnaissant l’anticorps primaire (c.-à-d., l’anticorps secondaire). Cette technique est très sensible ; le produit coloré résultant de la réaction enzymatique est photostable et nécessite seulement un microscope à fond clair pour l’imagerie. Cependant, immunomarquage chromogène peut ne pas convenir lorsque vous essayez de visualiser deux protéines qui co localiser, étant donné que la déposition d’une couleur peut masquer la déposition de l’autre. Dans le cas des taches, immunofluorescence s’est avéré pour être plus avantageux. L’avènement de l’immunofluorescence est attribuée à Albert Coons et ses collègues, qui a mis au point un système permettant d’identifier les antigènes de tissu avec des anticorps marqués à la fluorescéine et les visualiser dans les tissus sectionnés sous lumière ultraviolette³. Détection de fluorescence est issue d’un anticorps conjugué avec un fluorophore qui émet de la lumière après excitation. Parce qu’il y a plusieurs fluorophores avec des émissions aux longueurs d’onde différentes (avec peu ou pas de chevauchement), cette méthode de détection est idéale pour l’étude des protéines multiples.

La glande surrénale est un organe jumelé situé au-dessus du rein et se caractérise par deux éléments Embryologiquement distinctes, entourés par une capsule mésenchymateuse. Le cortex surrénalien externe, dérivé du mésoderme intermédiaire mésonéphriques, sécrète des hormones stéroïdes alors que la médullaire interne, dérivée de la crête neurale, produit des catécholamines dont l’adrénaline, la noradrénaline et la dopamine. Le cortex surrénalien est histologiquement et fonctionnellement divisé en trois zones concentriques, chaque zone sécrétant des différentes classes d’hormones stéroïdes : la zone extérieure glomérulée (zG) produit des minéralocorticoïdes qui régulent l’homéostasie de l’électrolyte et volume intravasculaire ; le milieu zona fasciculata (zF), directement sous le zG, sécrète des glucocorticoïdes médiateurs de la réponse au stress par la mobilisation des réserves énergétiques pour augmenter le taux de glucose plasmatique ; et les reticularis de zona interne (zR), qui synthétise le sexe précurseurs stéroïdes (c.-à-d., la déhydroépiandrostérone (SDHEA))⁴.

Certaines variations dans la corticosurrénale zonation sont présente entre les espèces : par exemple, Mus musculus manque le zR. L’unique zone X postnatale de M. musculus est un vestige du cortex foetal caractérisé par des petites cellules pauvres en lipides avec cytoplasmes acidophiles⁵. La zone X disparaît à la puberté chez les souris mâles et après la première grossesse chez les souris femelles, ou dégénère progressivement dans les femelles de race n’est pas^6,7. En outre, la tortuosité et l’épaisseur des pièces zG marqué la variation entre les espèces comme le fait l’Organisation des cellules souches et progénitrices périphériques dans et à côté de la zG. Le rat, à la différence des autres rongeurs, dispose d’une zone visible indifférenciée (zU) entre le zG et zF qui fonctionne comme une zone de cellules souches et/ou une zone transitoire amplifier les progéniteurs. Si la zone d’incertitude est unique à des rats ou simplement plus organisés en évidence amas de cellules sont inconnue^8,9.

Les cellules du cortex surrénal contiennent des gouttelettes de lipides qui stockent des esters de cholestérol qui servent comme le précurseur de toutes les hormones stéroïdes^10,11.  Le terme « stéroïdogenèse » définit le processus de production des hormones stéroïdes de cholestérol via une série de réactions enzymatiques qui impliquent l’activité du facteur stéroïdogénique 1 (SF1), dont l’expression est un marqueur potentiel stéroïdogènes. Dans la glande surrénale, expression Sf1 est présente uniquement dans les cellules du cortex¹². Une étude intéressante a trouvé l’expression de la biotine endogène dans les cellules corticosurrénales avec potentiel stéroïdogène¹³. Tandis que cela peut être la cause d’une formation supérieure en méthodes de coloration basé/streptavidine-biotine, en raison de la détection de biotine endogène par l’anticorps conjugué avec la Streptavidine, cette caractéristique pourrait être aussi employée pour distinguer le stéroïdogènes cellules des autres populations au sein de la glande surrénale, c.-à-d., endothélial, capsulaire et cellules de la moelle.

Innervé par les neurones préganglionnaires sympathiques, la médullosurrénale est caractérisée par des cellules basophiles avec un cytoplasme granulaire contenant de l’épinéphrine et la norépinéphrine. Cellules de la moelle sont nommés « chromaffines » en raison de la forte teneur des catécholamines qui forment un pigment brun après oxydation¹⁴. Tyrosine hydroxylase (TH) est l’enzyme qui catalyse l’étape cinétiquement limitante dans la synthèse des catécholamines et, dans la glande surrénale, s’exprime uniquement dans la médulla¹⁵.

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des glandes surrénales de souris, leur traitement pour l’enrobage de paraffine et de sectionnement et une méthode pour exécuter immunofluorescence souillant sur sections surrénales afin d’identifier les types cellulaires qui constituent la cortex surrénal et la moelle. Ce protocole est une norme dans notre laboratoire pour l’immunohistochimie avec des anticorps multiples utilisés couramment dans nos recherches.