Summary

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Abstract

O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.

Introduction

Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,1,2,3 . Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolando, rastejando, prisão, migração de transendothelial (transmigração) e migração através da parede do vaso (membrana basal e mural células)4. Estes passos envolvem principalmente moléculas induzida por inflamação na superfície luminal endotelial como selectinas, ligantes de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adesão intercelular e juncional e seus receptores em leucócitos como selectina ligantes e integrinas. Vias de tráfico através das junções de célula endotelial (paracellular) ou através do corpo de célula endotelial (transcellular) podem ser usadas por leucócitos de atravessar a barreira endotelial5. Enquanto os monócitos historicamente foram documentados a transmigrar através da rota de transcellular, potenciais divergências no seu percurso migratório têm sido propostas como os monócitos já não são considerados uma população celular homogênea. Agora está se tornando claro que a diversidade de monócitos podem ser definidos por cada uma das suas diferenças e semelhanças, com relação a sua distintivo extravasamento cascatas de3,6. Portanto, para inequivocamente discriminar entre subpopulações de monócitos, é crucial Visualizar e processar o fenótipo o comportamento de cada uma dessas subpopulações diferentes durante o recrutamento.

Monócitos do humano, porco, rato e rato foram subdivididos em subpopulações fenotípicas com determinadas funções anexam e comportamentos migratórios específicos7,8,9. Por exemplo, em humanos, monócitos podem ser divididos em três subgrupos com base em sua expressão de superfície de CD14, um co-receptor para lipopolissacarídeo bacteriano e CD16, o receptor de Fc-gama III. Subpopulações de monócitos humanos incluem CD14 clássica+CD16, intermediário CD14+CD16+ e não-clássica CD14dimCD16 células de+ 6,9. O CD14 clássica+CD16 monócitos foram mostrados para ser inflamatória principalmente considerando que a piscina de CD16+ monócitos coletivamente foram encontrados para apresentar TIE2 expressão e proangiogenic função10. Consistentemente, estimulação de células endoteliais com citocinas inflamatórias, tais como necrose de tumor humano fator α (TNF) ou interleucina (IL-1) beta (inflamação convencional) é suficiente para desencadear o recrutamento completo de CD14 clássica+CD16 monócitos . No entanto, ações simultâneas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) A e TNFa (angiogênico orientada por fatores inflamação) são necessárias para provocar a transmigração do CD16+ proangiogenic piscina de monócitos3. Historicamente, o sistema tradicional de Transwell sob condições estáticas, a câmara de fluxo paralelo placa e câmaras de fluxo de µ-slide têm sido utilizados para analisar quantitativamente o recrutamento da população de leucócitos de um em um tempo em vitro11 ,12,13. Enquanto estes protocolos validados, um método mais robusto que permitiu a análise simultânea de várias subpopulações de monócitos seria considerado mais perspicaz. Tais metodologias devem contabilizar várias interações e as diferentes frequências de cada respectiva população e também fornecer uma compreensão mecanicista das semelhanças e especificidades para as cascatas de recrutamento que definem cada monócito subconjunto.

Aqui, apresentamos um método baseado sobre a lapso de tempo por imagens do recrutamento de monócitos sob fluxo que permite que o cascades migratórias de subpopulações diferentes monócitos para ser estudado simultaneamente usando microscopia confocal. Este método integra determinados recursos críticos que imitam a inflamação da célula endotelial, bem como a hemodinâmica de monócitos em vênulas pós-capilares, que circula o principal local de recrutamento de leucócitos em vivo. O método proposto utiliza células endoteliais veia umbilical humana (HUVEC), que são geradas através de um protocolo bem estabelecido de isolamento de cabos de cordão umbilical humanos. Este recurso clínico tem a vantagem de ser facilmente disponível como um subproduto biológico, e também proporcionar um rendimento razoável de células endoteliais, que podem ser isolados da veia umbilical. Também usamos corantes fluorescentes e imunofluorescência para distinguir entre os diferentes componentes celulares e microscopia confocal para definir inequivocamente monócito posicionamento (luminal vs abluminal) ao longo do tempo. O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido a medida simultaneamente os níveis de transmigração de subpopulações de monócitos. Além disso, deve notar-se que esta metodologia pode ser estendida para estudar outras subpopulações de leucócitos e processos de recrutamento, pelo uso de diferentes biomarcadores e rotulagem.

Protocol

Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica. 1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC) Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC. Limpe o cabo com PBS, limpe-a com comp…

Representative Results

Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM…

Discussion

Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de11,3,19. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Paul Bradfield para manuscrito lendo e feedbacks. A.s. recebeu apoio financeiro do senhor Jules Thorn caridade ultramarinos Trust reg.,

Materials

Tissue Culture Flasks 75 cm2 TPP 90076 Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4 IBIDI 80606
Centrifuge Tubes 15 mL TPP 191015
Centrifuge Tubes 50 mL TPP 191050
Collagen G Biochrom L 7213 For coating of cell culture flasks
Gelatin Sigma-Aldrich 1393 For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
3-Way Stopcocks BIO-RAD 7328103
penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml AMIMED 4-02F00-H
Collagenase type 1 Worthington LS004216
Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes GIBCO 22340020
Bovine Albumin Fraction V ThermoFisher 15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg Millipore 02-102
Heparin Sodium Sigma-Aldrich H3149RT
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H6909
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O APPLICHEM A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC Miltenyi Biotech 130-100-713 AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE Miltenyi Biotech 130-110-807 AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC Miltenyi Biotech 130-107-016 AB_2653263
BD Accuri C6 Plus BD Bioscience
µ-Slide I Luer IBIDI 80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) ThermoFisher C2925
Recombinant human TNFα Peprotech 300-01A
Recombinant human VEGFA Peprotech 100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump KF Technology NE-1000
Ficoll Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE Miltenyi Biotech 130-110-519 AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human Miltenyi Biotech 130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE Miltenyi Biotech 130-106-762 AB_2655403
LS columns Miltenyi Biotech 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech 130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate ThermoFisher H1399
Silicone tubing IBIDI 10841
Elbow Luer Connector IBIDI 10802
Female Luer Lock Coupler IBIDI 10823
Luer Lock Connector Female IBIDI 10825
In-line Luer Injection Port IBIDI 10820
Ar1 confocal microscope Nikon
40X objective Nikon 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software NIH

References

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Cite This Article
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).

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