Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Monozyten bilden eine phagocytic Komponente der angeborenen Immunität, die wichtig für die Bekämpfung von Krankheitserregern, Bereinigen von beschädigtem Gewebe, Angiogenese und der Pathophysiologie von vielen Krankheiten, einschließlich Krebs^1,2,3 . Monozyten sind Knochenmark gewonnenen Zellen bestehend aus heterogener Subpopulationen, die im Blut zirkulieren, aber können an den Ort der Entzündung im peripheren Gewebe durch spezifische molekulare Mechanismen rekrutiert werden. Die Rekrutierung Kaskaden von Monozyten, wie bei Leukozyten impliziert in der Regel verschiedene Schritte einschließlich der Erfassung, Rollen, krabbeln, Verhaftung, Transendothelial Migration (Seelenwanderung) und Migration durch die Gefäßwand (Basalmembran und Wandbild Zellen)⁴. Diese Schritte beinhalten vor allem Entzündungen-induzierte Moleküle auf der endothelialen luminalen Oberfläche z. B. Selectins Glykoprotein Liganden, Chemokine, Knoten und interzelluläre Adhäsionsmoleküle und ihre Rezeptoren auf Leukozyten wie Selektin-Liganden und Integrine. Handel Wege über entweder die Endothelzellen Kreuzungen (parazellulär) oder über die endotheliale Zellkörper (transzelluläre) lässt sich die endotheliale Barriere⁵überqueren von Leukozyten. Während Monozyten historisch dokumentiert worden sind, um durch die transzelluläre Route transmigrate wurden mögliche Unterschiede in ihren wandernden Weg da Monozyten nicht mehr als eine homogene Zellpopulation gelten vorgeschlagen. Es wird jetzt klar, dass Monocyte Vielfalt kann von jedem ihrer Unterschiede und Gemeinsamkeiten definiert werden, in Bezug auf ihre unverwechselbare Extravasation Kaskaden^3,6. Daher, um eindeutig zwischen Monocyte Subpopulationen unterscheiden, ist es entscheidend, zu visualisieren und Phänotyp das Verhalten der einzelnen von diesen verschiedenen Subpopulationen während der Rekrutierung verarbeiten.

Monozyten von Mensch, Schwein, Ratte und Maus waren unterteilt in phänotypischen Subpopulationen mit bestimmten zugeschriebenen Funktionen und spezielle wandernden Verhaltensweisen^7,8,9. Beispielsweise können beim Menschen, Monozyten drei Teilmengen basierend auf deren Oberflächenexpression von CD14, ein Coreceptor für bakterielle Lipopolysaccharid und CD16, den Fc-Gamma-Rezeptor III unterteilt werden. Menschliche Monocyte Subpopulationen gehören klassische CD14⁺CD16^–, Mittelstufe CD14⁺CD16⁺ und nicht-klassischen CD14^dimCD16^{+ 6,9}Zellen. Die klassische CD14⁺CD16^– Monozyten erwiesen sich vor allem entzündliche während der Pool von CD16⁺ Monozyten fanden sich kollektiv TIE2 Ausdruck und Proangiogenic Funktion¹⁰zu präsentieren. Konsequent, Endothelzellen Stimulation mit inflammatorischen Zytokinen wie menschliche Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α oder Interleukin (IL-1) Beta (konventionelle Entzündung) ist ausreichend, um die komplette Einstellung von klassischen CD14 auslösen⁺CD16 ^– Monozyten. Simultane Aktionen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) A und TNF (angiogenen Faktoren angetrieben Entzündung) sind jedoch erforderlich, um die Seelenwanderung die CD16 provozieren⁺ Proangiogenic Pool von Monozyten³. Historisch gesehen, das traditionelle Transwell-System unter statischen Bedingungen, die parallelen Platten Strömungsraum und die µ-Folie Fluss Kammern wurden verwendet, um quantitativ zu analysieren, die Rekrutierung von Leukozyten eine Bevölkerung an eine Zeit in-vitro-^{11 ,12,13}. Während diese Protokolle validiert wurden, würde eine robustere Methode, die erlaubt die simultane Analyse von mehreren Monocyte Subpopulationen einsichtsvolleren betrachtet werden. Solche Methoden müssen mehrere Interaktionen und die unterschiedlichen Frequenzen jedes jeweiligen Bevölkerung ausmachen und auch bieten ein mechanistisches Verständnis für die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten für die Rekrutierung-Kaskaden, die jede Monocyte definieren Teilmenge.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode basiert auf der Time-Lapse Bildgebung der Monocyte Rekrutierung durch fließen, wodurch die wandernden Kaskaden von verschiedenen Monocyte Subpopulationen gleichzeitig untersucht werden, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Diese Methode integriert bestimmte kritische Funktionen, die Endothelzellen Entzündung sowie die Hämodynamik des zirkulierenden Monozyten in Post-Kapillaren Venolen, am Hauptstandort der Leukozyten Rekrutierung in vivo zu imitieren. Die vorgeschlagene Methode verwendet menschliche Nabelader Endothelzellen (HUVECS), die durch ein etabliertes Protokoll der Isolation von menschlichen Nabelschnur erzeugt werden. Diese klinische Ressource hat den Vorteil des Seins leicht zugänglich als Nebenprodukt biologischer, während auch eine vernünftige Rendite von Endothelzellen, die von der Nabelader isoliert werden können. Wir auch zur Fluoreszenz-Farbstoffen und Immunfluoreszenz Unterscheidung der verschiedenen zellulären Komponenten und konfokalen Mikroskopie eindeutig definieren Monocyte Positionierung (luminalen vs. abluminalen) im Laufe der Zeit. Die hier vorgestellten Protokoll wurde gleichzeitig messen die Seelenwanderung Ebenen der Monocyte Subpopulationen entwickelt. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass diese Methodik auf um andere Leukozyten-Subpopulationen und Einstellungsverfahren zu studieren erweitert werden kann, durch Einsatz von verschiedenen Biomarker und Kennzeichnung.