Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Monocytes constituent une composante phagocytaire de l’immunité innée qui est essentielle pour la lutte contre les agents pathogènes, nettoyer les tissus endommagés, l’angiogenèse et la pathophysiologie de nombreuses maladies dont les cancers^1,2,3 . Les monocytes sont des cellules dérivées de la moelle osseuse composées de populations hétérogènes qui circulent dans le sang, mais peuvent être recrutées sur le site de l’inflammation dans les tissus périphériques par le biais de mécanismes moléculaires spécifiques. Les cascades de recrutement des monocytes, en ce qui concerne les leucocytes en général, implique différentes étapes, y compris la capture, rouler, ramper, arrestation, la migration transendothéliale (transmigration) et migration à travers la paroi des vaisseaux (membrane basale et peinture murale ⁴de cellules). Ces mesures concernent principalement induite par l’inflammation des molécules sur la surface endothéliale luminale comme sélectines, ligands glycoprotéine, chimiokines, molécules d’adhésion intercellulaire et jonctionnel et leurs récepteurs sur leucocytes comme sélectine ligands et les intégrines. Voies de trafic à travers les jonctions de cellules endothéliales (paracellulaires) ou par l’intermédiaire de l’organisme de cellules endothélial (transcellulaire) peuvent être utilisés par les leucocytes de franchir la barrière endothéliale⁵. Tandis que les monocytes ont historiquement été documentés à transmigrer la voie transcellulaire, divergences potentielles dans leur voie migratoire ont été proposés comme monocytes ne sont plus considérés comme une population homogène de cellules. Il est maintenant évident que la diversité des monocytes peuvent être définies par chacun de leurs différences et points communs, en ce qui concerne leur extravasation distinctive cascades^3,6. Par conséquent, afin de distinguer sans ambiguïté les sous-populations de monocytes, il est crucial de visualiser, et le processus de phénotype le comportement de chacun de ces différentes sous-populations lors du recrutement.

Monocytes d’être humain, porc, rat et souris ont été subdivisées en sous-populations phénotypiques avec certaines fonctions attribuées et les comportements migratoires spécifiques^7,8,9. Par exemple, chez les humains, monocytes se divisent en trois sous-ensembles basés sur leur expression superficielle de CD14, un corécepteur pour lipopolysaccharide bactérien et CD16, les récepteurs Fc-gamma III. Sous-populations de monocyte humain incluent CD14 classique⁺CD16^–, les intermédiaires CD14⁺CD16⁺ et non-classique CD14^dimCD16⁺ cellules^6,9. Le CD14 classique⁺CD16^– monocytes se sont avérées être principalement inflammatoire alors que la piscine du CD16⁺ monocytes trouvées collectivement de présenter TIE2 expression et on fonction¹⁰. Régulièrement, la stimulation des cellules endothéliales par des cytokines inflammatoires telles que la nécrose de tumeur humaine facteur α (TNF) ou l’interleukine (il-1) beta (inflammation conventionnelle) est suffisante pour déclencher le recrutement complet de CD14 classique⁺CD16 ^– monocytes. Cependant, des actions simultanées de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) A et de TNFα (inflammation d’axée sur les facteurs angiogéniques) sont nécessaires pour provoquer la transmigration de le CD16⁺ on piscine de monocytes³. Historiquement, le système traditionnel de Transwell sous des conditions statiques, la chambre de flux de plaques parallèles et les chambres de débit µ-diapositive ont été utilisées pour analyser quantitativement le recrutement de la population à un moment en vitro^{11 un leucocyte ,12,13}. Tandis que ces protocoles ont été validés, une méthode plus robuste permettant l’analyse simultanée de plusieurs sous-populations de monocyte serait considérée comme plus perspicace. Ces méthodes doivent tenir compte des interactions multiples et les différentes fréquences de chaque population respective et également fournir une interprétation mécaniste des similarités et des spécificités pour les cascades de recrutement qui définissent chaque monocyte sous-ensemble.

Nous présentons ici une méthode basée sur l’imagerie Time-lapse de recrutement de monocytes sous flux qui permet les cascades migrateurs des sous-populations de monocyte différents à étudier simultanément à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode intègre certaines caractéristiques essentielles qui imitent l’inflammation des cellules endothéliales, ainsi que l’hémodynamique des monocytes dans les veinules post capillaires, en circulation l’emplacement principal du recrutement des leucocytes in vivo. La méthode proposée utilise des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont générés par un protocole bien établi d’isolement du humaine de cordons ombilicaux. Cette ressource clinique a l’avantage d’être facilement disponible comme sous-produit biologique, tout en fournissant également un rendement raisonnable des cellules endothéliales qui peuvent être isolés dans la veine ombilicale. Nous avons également utilisé les colorants fluorescents et immunofluorescence d’établir une distinction entre les différents composants cellulaires et microscopie confocale de définir sans ambiguïté le monocyte positionnement (luminal vs abluminal) au fil du temps. Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer simultanément les niveaux de la transmigration des sous-populations de monocytes. En outre, il convient de noter que cette méthode peut être étendue afin d’étudier les autres sous-populations de leucocytes et le processus de recrutement par l’utilisation de différents biomarqueurs et l’étiquetage.