南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

人事によるマウス ES 細胞のターゲット遺伝子の技術は、特定の遺伝の突然変異の^1,2の細胞の結果を解剖するための強力なツールを提供します。この技術の意義と重要性は生理学または薬^3,4の 2007 年のノーベル賞の認識に反映されます。一方、遺伝子工学⁵のモダンな時代の到来を表します。Hr ターゲット遺伝子は、マウス ES 細胞^6、7のゲノムの大規模な染色体再配列に点突然変異に至るあらゆる変化を設計する利用できます。よく知られている遺伝子ノックアウト マウスの世代は、いわゆるゲノム編集ツールの出現前に、ES 細胞^8,9,10の遺伝子ターゲティング技術の応用も必要です。過去 20 年間、5,000 以上の遺伝子をターゲットとしたマウスはヒトの病気のモデル化や遺伝子機能¹¹を勉強してこのアプローチによって生成されました。ゲノム ノックアウト努力標的遺伝子ベクトル、目標とされた ES 細胞クローン、および科学界^2,12,13,14に生きたマウスを配布するために設立されました^,15. 確かに、ES 細胞を用いた人事を介した標的遺伝子技術は大きく進歩遺伝子生理学的または病理学的コンテキストで再生の機能の私達の理解。

マウス ES 細胞のターゲット遺伝子起因の突然変異で、いくつかのクローンを識別するための多数の ES 植民地を分析することです時間は哺乳類で比較的頻度の低いイベント^16,17、重要な細胞し、次の次のステップターゲット ベクトル¹⁸HR。南しみが付くことおよび PCR^19,20金 HR イベントを識別する方法があります。アプローチのメリットは、南しみが付くこと正しく目標とされた ES のクローンを識別することができ、コンストラクトの単一コピー挿入の確認など、遺伝子をターゲットとしたイベントの構造を解析する研究者を許可しながら、PCR に基づく戦略人事イベント^21,22のより迅速なスクリーニングを許可します。これらのメソッドが、欠点など、彼らは時間がかかると、ことができますが、それらの組合せの使用の偽陽性、幅広く受け入れられ HR イベントの識別のほとんどの演習で適用、特に ES 細胞で遺伝子の生成の変更動物。

哺乳類で、それぞれ 3 つの異なる遺伝子 (名前付き Myh9、Myh10、および Myh14) と軽鎖の 2 つのペアでエンコードされた 2 つの同一の NMHC IIs で構成される非ミオシン II (NM II) の 3 つのアイソ フォームは、NM II、II B、および II C²³と呼ばれます。以前研究が少なくともそれを示されている NM II、II B のアイソ フォームは、これらのアイソ フォームの生体内でアブレーションの結果胚性致死^24,25,26マウスの開発のために不可欠です。採用された戦略の ES 細胞を用いた人事を介した遺伝子ターゲット技術を使用してこの問題を回避し、マウス開発、遺伝子交換の後の段階で NM II、II B のアイソ フォームに固有の機能に新しい洞察力を得るマウス モデル²⁷のシリーズを生成します。希望の ES クローンを識別する過程で南にしみが付くことおよび PCR 法が活かされてとこれらが効率的かつ信頼性の高い^27,28をあることを証明しました。

本稿は、南しみが付くことおよび PCR、vector(s)、渦、プライマー、および HR イベントの識別に代表される結果の分析だけでなく、実験の実行をターゲットのデザインなどの詳細な説明を提供するためにしようとします。ES 細胞モデルと代表的なデータ、遺伝交換 NM II マウスを作成するために発生します。ここに示す 2 つのメソッドのプロトコルは、遺伝子組み換え細胞や動物の遺伝子型を識別するためも採用できます。