Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa
Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.
Abstract
Relativo a las cuestiones de efectos off-target y la dificultad de insertar un largo fragmento de ADN en la aplicación de diseño nucleasas para edición tallo genoma embrionario (ES) de la célula gene targeting tecnología no tiene estas deficiencias y es ampliamente utilizado para modificar el genoma del animal y el ratón que van desde grandes deleciones/inserciones a sustituciones de un solo nucleótido. En particular, identificando los relativamente pocos eventos de recombinación homóloga (HR) necesarios para obtener el deseado ES clones es un paso fundamental, que exige métodos precisos y fiables. Southern blot y/o PCR convencional se utiliza a menudo para este propósito. Aquí, describimos los procedimientos detallados de la utilización de estos dos métodos para identificar eventos de recursos humanos que ocurrieron en células ES de ratón que el gen Myh9 endógeno pretende ser interrumpida y reemplazada por cDNAs codifican otros cadena pesada del myosin UROLOGICAL IIs (IIs de NMHC). Todo el procedimiento de borrar meridional incluye la construcción de objetivos vector(s), electroporación, selección de drogas, la expansión y el almacenamiento de las células ES/clones, preparación, digestión y blot de DNA genómico (gDNA), la hibridación y lavado de sonda y un paso final de la autorradiografía en las películas de rayos x. PCR se puede realizar directamente con gDNA preparada y diluida. Para obtener resultados ideales, las sondas y la enzima de la restricción (RE) sitios de corte para borrar meridional y los cebadores para PCR deben ser cuidadosamente planificadas. Si la ejecución de borrar meridional es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva y PCR resultados falsos positivos, la correcta identificación por borrar meridional y el cribado rápido por PCR permite la aplicación única o en combinación de estos métodos descritos en este documento para ser ampliamente utilizado y consultado por los laboratorios más en la identificación de genotipos de células madre embrionarias y genéticamente modificados animales.
Introduction
La tecnología del gene targeting por HR en células de madre embrionarias murinas proporciona una poderosa herramienta para disecar las consecuencias celulares de mutaciones genéticas específicas1,2. La importancia y el significado de esta tecnología se reflejan en su reconocimiento por el Premio 2007 Nobel en la fisiología o la medicina3,4; mientras tanto, representa el advenimiento de la era moderna de la ingeniería gen5. Gene targeting por hora puede ser utilizado para diseñar prácticamente cualquier alteración que van desde mutaciones puntuales a grandes cambios cromosómicos en el genoma del ratón ES células6,7. Es bien sabido que, antes de la aparición de herramientas de edición llamado genoma, la generación de un ratón knockout de genes requiere la aplicación de tecnología gene targeting en ES las células8,9,10. Durante las últimas dos décadas, más de 5.000 ratones dirigidos por gene fueron producidos por este enfoque para modelar enfermedades humanas o el estudio de las funciones del gen11. Un esfuerzo de nocaut en el genoma se ha establecido para la distribución de vectores gene targeting objetivos clones de células ES y ratones vivos a la comunidad científica2,12,13,14 , 15. sin duda, ES celular tecnología basada en HR-mediated gene targeting ha avanzado grandemente nuestra comprensión de las funciones de los genes en el contexto fisiológico o patológico.
Debido a que HR es un evento relativamente infrecuente en mamíferos células16,17, la importante y siguiente paso después de gene targeting en células de madre embrionarias murinas es analizar numerosas colonias ES para la identificación de algunos clones con mutaciones resultantes de Recursos humanos con el objetivo de vectores18. Los métodos del oro para la identificación de eventos de recursos humanos incluyen Southern blot y PCR19,20. Las ventajas de los enfoques incluyen que borrar meridional puede identificar clones ES correctamente dirigidas y permite a los investigadores a analizar la estructura del evento dirigido de genes, como una verificación de una inserción de copia única de la construcción, mientras que un Estrategia basada en la PCR permite la detección más rápida de HR eventos21,22. Aunque estos métodos tienen inconvenientes, como que son lentos y pueden tener falsos positivos, el uso de la combinatoria de ellos es ampliamente aceptados y aplicados por los laboratorios más en la identificación de eventos de recursos humanos, particularmente en células madre embrionarias, para generar genéticamente modificado animales.
Tres isoformas de la miosina UROLOGICAL II (NM II) en los mamíferos, cada uno con dos IIs NMHC idénticos que son codificadas por tres genes diferentes (llamado Myh9 Myh10 y Myh14) y dos pares de cadenas ligeras, se denominan NM II-A, II B y II-C23. Estudios previos han indicado que al menos las isoformas de NM II-A y II-B son esenciales para el desarrollo del ratón debido a la ablación en vivo de estas isoformas en mortalidad embrionaria24,25,26. Para evitar este problema y obtener nuevos conocimientos sobre las funciones específicas de la isoforma de NM II-A y II-B en las últimas etapas del desarrollo del ratón, un reemplazo genético estrategia tecnología ES celular HR-mediated gene targeting se adoptó para generar una serie de modelos de ratón27. En el curso de identificación de los clones ES deseados, borrar meridional y los métodos de PCR fueron utilizados, y estas demostraron para ser eficiente y confiable27,28.
Este documento pretende proporcionar una descripción detallada de Southern blotting y PCR, incluyendo el diseño de la focalización vector(s), sonda y cartillas y la ejecución de los experimentos, así como el análisis de resultados ejemplificados mediante la identificación de eventos de recursos humanos ocurrencia en células madre embrionarias para la creación de ratón de recambio genético NM II modelos y datos representativos. Los protocolos de estos dos métodos presentados aquí también pueden ser adoptados para la identificación de los genotipos de células genéticamente modificadas o los animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la actualidad, diseñador nucleasas para la edición del genoma todavía no pueden reemplazar ES célula gene targeting tecnología debido a sus problemas de efectos off-target y dificultad en la inserción de un ADN largo fragmento30,31. Como los métodos de oro para identificar eventos de HR que se producido en células de ratón ES, este informe proporciona un protocolo detallado de Southern blot y de PCR para el campo. Validamos la fiabilidad de estos mét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo recibió apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones no. 31571432), el humano Provincial Ciencias naturales Fundación de China (Grant No. 2015JC3097) y la investigación Fundación de Educación Oficina de Hunan Provincia, China (Grant no. 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
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