Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.
Abstract
Im Verhältnis zu den Fragen der Ziel-Effekte und die Schwierigkeit des Einsetzens einer langen DNA-Fragment in der Anwendung von Designer Nukleasen für Genom Bearbeitung, embryonale Stammzellen (ES) Zell-basierte gen-targeting Technologie verfügt nicht über diese Mängel und ist weithin verwendet, um Tier/Maus Genom von großen Deletionen/Insertionen bis hin zu Einzel-Nukleotid-Substitutionen ändern. Vor allem gewünscht Identifizierung von relativ wenigen homologe Rekombination (HR) Veranstaltungen notwendig ES-Klone ist ein wichtiger Schritt, der genaue und zuverlässige Methoden verlangt. Südliche beflecken und/oder konventionellen PCR werden häufig für diesen Zweck genutzt. Hier beschreiben wir die Modalitäten der Verwendung dieser beiden Verfahren HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen aufgetreten in denen endogene Myh9 gen gestört und durch cDNAs Codierung andere Nonmuscle Myosin schwere Kette IIs (NMHC IIs) ersetzt werden soll. Das gesamte Verfahren der Southern blotting umfasst den Bau von Vector(s), Elektroporation, Droge-Auswahl, Ausbau und Lagerung von ES-Zellen/Klone, die Vorbereitung, Verdauung-targeting und Beflecken der genomic DNA (gDNA), die Hybridisierung und Waschen der Wortanzahl und letzten Schritt der Autoradiographie auf die x-ray-Filme. PCR kann direkt mit vorbereitet und verdünnte gDNA durchgeführt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Sonden und Restriktionsenzym (Re-) schneiden Websites für das südliche beflecken und die Primer für PCR sorgfältig geplant werden. Obwohl die Ausführung von Southern blotting ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und PCR-Ergebnisse sind Fehlalarme, die korrekte Identifizierung von Southern blotting und die schnelle Screening mittels PCR erlauben die alleinige oder kombinierte Anwendung dieser Methoden beschrieben in diesem Papier auf allgemein verwendet und Anhörung durch die meisten Labore bei der Identifizierung von Genotypen von ES-Zellen und genetisch veränderter Tiere.
Introduction
Die Technologie der Gene targeting-HR in murinen embryonaler Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool für sezieren die zellulären Folgen von bestimmten Genmutationen1,2. Die Bedeutung und die Bedeutung dieser Technologie spiegeln sich in der Anerkennung von 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin3,4; Unterdessen stellt es das Aufkommen der modernen Ära von gen-engineering-5. Gene targeting durch HR kann genutzt werden, um praktisch jede Änderung von Punktmutationen bis hin zu großen chromosomale Rearrangements im Genom der Maus ES Zellen6,7-Ingenieur. Es ist bekannt, dass vor der Entstehung der sogenannten Genome editing-Tools, die Generation von einer gen-Knockout-Maus die Anwendung der Gene-targeting Technologie ES Zellen8,9,10erforderlich. In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden mehr als 5.000 gen gezielt Mäuse durch diesen Ansatz für die Modellierung menschlicher Erkrankungen oder studieren gen Funktionen11produziert. Eine genomweite Ko Anstrengung hat sich etabliert für die Verteilung von gen-targeting Vektoren, gezielte ES Zellklonen und live Mäuse an die wissenschaftliche Gemeinschaft2,12,13,14 , 15. zweifellos, ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting-Technologie hat stark erweiterte unser Verständnis der Funktionen von Genen in physiologische oder pathologische Kontext gespielt.
Weil HR ist eine relativ seltene Ereignis in Säugetier-Zellen16,17, die wichtig und nächster Schritt nach soll gen gezielt in murinen Embryonische Stammzellen zahlreiche ES Kolonien zur Identifizierung von ein paar Klone mit Mutationen aus analysieren Mit dem targeting Vektor-18Std. Die gold Methoden zur Identifizierung von HR-Veranstaltungen gehören südliche beflecken und PCR19,20. Die Vorteile der Ansätze beinhalten, dass Southern blotting richtig gezielte ES-Klone zu identifizieren und erlaubt es den Forschern, die Struktur der gen ausgerichtete Veranstaltung, wie eine Überprüfung der eine einzelne Kopie Einfügung des Konstrukts, analysieren während einer PCR-basierte Strategie ermöglicht eine schnellere Screening für HR Veranstaltungen21,22. Obwohl diese Methoden Nachteile, wie z. B. haben, dass sie sind zeitaufwendig und können Fehlalarme, die kombinatorische Nutzung von ihnen ist weithin akzeptiert und angewendet, indem die meisten Labore bei der Identifizierung von HR-Veranstaltungen, insbesondere in ES-Zellen für Erzeugung genetisch geändert Tiere.
Drei Isoformen von Nonmuscle Myosin II (NM II) bei Säugetieren, jeweils bestehend aus zwei identischen NMHC IIs die durch drei verschiedene Gene (benannte Myh9, Myh10 und Myh14) und zwei Paare von Lichterketten, kodiert sind gekennzeichnet als NM II A, II B und II-C23. Frühere Studien haben gezeigt, dass mindestens der Isoformen von NM II A und II B sind wesentlich für Maus Entwicklung, da die in Vivo -Ablation von diese Isoformen embryonalen Tödlichkeit24,25,26führt. Um dieses Problem zu umgehen und erhalten neue Einblicke in die Isoform-spezifischen Funktionen der NM II A und II B in den späteren Stadien der Maus Entwicklung, ein genetischer Austausch war ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting Technologie, Strategie erzeugen Sie eine Reihe von Maus Modelle27. Im Zuge der Ermittlung der gewünschten ES-Klone, Southern blotting und PCR-Methoden wurden eingesetzt, und diese erwies sich als effiziente und zuverlässige27,28.
Dieses Papier soll eine detaillierte Beschreibung der südlichen Beflecken und PCR, einschließlich der Gestaltung von targeting, Vector(s), Wortanzahl, und Primer und die Durchführung von Experimenten sowie die Analyse der Ergebnisse durch die Identifizierung von HR-Ereignis veranschaulicht Vorkommen in ES-Zellen für die Erstellung von genetischen Austausch NM II Maus Modelle und repräsentative Daten. Die Protokolle der beiden hier vorgestellten Methoden können auch für die Ermittlung der Genotypen von genetisch veränderten Zellen oder Tieren angenommen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derzeit können Designer Nukleasen für Genom-Bearbeitung noch nicht ES zellbasierte Gene-targeting Technologie aufgrund ihrer Probleme von Ziel-Effekten und Schwierigkeiten beim Einfügen einer langen DNA-Fragment30,31ersetzen. Dieser Bericht enthält als die goldenen Methoden zur Identifizierung von HR Ereignisse in Maus-ES-Zellen, ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR für das Feld. Wir validiert die Zuverlässigkeit dieser Methoden durch d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit erhielt Unterstützung durch das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (Grants Nr. 31571432), die menschlichen Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) und der Forschung Grundlage der Bildung Bureau Hunan Provinz, China (Grant Nr. 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
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