Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.
Abstract
O cloroplasto é uma organela essencial que é responsável por vários processos celulares em plantas, tais como a fotossíntese e a produção de muitos metabólitos secundários e lipídios. Cloroplastos exigem um grande número de proteínas para estes vários processos fisiológicos. Mais de 95% de proteínas cloroplasto são importados em cloroplastos de citoplasma e núcleo-codificado após a tradução em ribossomas citosólica. Assim, a importação correta ou direcionamento destas proteínas codificadas núcleo cloroplasto de cloroplastos é essencial para o bom funcionamento dos cloroplastos, bem como a célula vegetal. Proteínas codificadas núcleo cloroplasto contém sequências de sinal para o direcionamento específico de cloroplastos. Máquinas moleculares localizadas para o cloroplasto ou citosol reconhecer estes sinais e realizar o processo de importação. Para investigar os mecanismos de importação de proteínas ou segmentação de cloroplastos em vivo, desenvolvemos um método baseado em protoplastos rápido e eficiente para analisar a importação de proteínas em cloroplastos de Arabidopsis. Neste método, usamos protoplastas isolados de tecidos folha de Arabidopsis. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para uso protoplastas para investigar o mecanismo pelo qual as proteínas são importadas em cloroplastos.
Introduction
O cloroplasto é dentre as organelas mais importantes em plantas. Uma das principais funções dos cloroplastos é realizar fotossíntese1. Cloroplastos também realizam muitas outras reações bioquímicas para a produção de ácidos graxos, aminoácidos, nucleotídeos e muitos metabólitos secundários1,2. Para todas estas reacções, cloroplastos exigem um grande número de diferentes tipos de proteínas. No entanto, o genoma do cloroplasto contém apenas cerca de 100 genes3,4. Portanto, cloroplastos devem importar a maioria das suas proteínas do citosol. Na verdade, a maioria das proteínas cloroplasto foram mostrados para ser importadas do citosol após tradução4,5,6. Células vegetais requerem mecanismos específicos para importar proteínas do citosol de cloroplastos. No entanto, apesar desses mecanismos de importação de proteínas têm sido investigados há várias décadas, ainda não compreendemos-los a nível molecular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para preparar protoplastas e exogenamente expressando genes em protoplastas. Esse método pode ser valioso para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes a importação de proteínas em cloroplastos em detalhe.
Importação de proteínas pode ser estudada usando muitas abordagens diferentes. Um destes métodos envolve o uso de um em vitro proteína importação sistema7,8. Usando essa abordagem, em vitro-precursores de proteínas traduzidas são incubados com cloroplastos purificada em vitro, e importação de proteínas é analisada por SDS-PAGE, seguido de análise ocidental do borrão. A vantagem dessa abordagem é que cada passo da importação de proteínas em cloroplastos pode ser estudado em detalhe. Assim, este método foi amplamente utilizado para definir os componentes da maquinaria molecular da proteína importação e dissecar informações de sequência de peptídeos de trânsito. Mais recentemente, foi desenvolvida uma outra abordagem envolvendo o uso de protoplastas de tecidos de folhas e ele tornar-se amplamente utilizados para estudar a importação de proteínas em cloroplastos9,10. A vantagem dessa abordagem é que protoplastas de fornecem um ambiente celular que está mais próximo ao de células intactas, que o sistema in vitro . Assim, o sistema de protoplastos nos permite abordar muitos aspectos adicionais deste processo, tais como os eventos associados citosólico e como a especificidade dos sinais de direcionamento é determinada. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o uso de protoplastas para estudar a importação de proteínas em cloroplastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de protoplastas de Arabidopsis para estudar a importação de proteínas em cloroplastos. Este método é muito poderoso para investigar o processo de importação de proteínas. Esta técnica simples e versátil é útil para examinar o direcionamento das proteínas de carga pretendida para os cloroplastos. Usando esse método, protoplastas são preparados a partir de tecidos de folha de Arabidopsis11,<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi realizado com o suporte do programa de pesquisa cooperativa para a agricultura ciência e tecnologia de desenvolvimento (projeto n. º PJ010953012018), administração de Desenvolvimento Rural e a concessão da Fundação Nacional de pesquisa (Coreia) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (n º 2016R1E1A1A02922014), República da Coreia.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
