Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti
Summary
Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.
Abstract
Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l’importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.
Introduction
Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi1. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle loro proteine dal cytosol. Infatti, la maggior parte delle proteine del cloroplasto sono stata indicata per essere importati dal cytosol dopo traduzione4,5,6. Cellule vegetali richiedono meccanismi specifici per l’importazione di proteine dal cytosol ai cloroplasti. Tuttavia, anche se questi meccanismi di importazione di proteina sono stati studiati per i parecchi decenni passati, ancora non completamente capiamo loro a livello molecolare. Qui, forniamo un metodo dettagliato per la preparazione di protoplasti ed esogenicamente che esprimono i geni in protoplasti. Questo metodo potrebbe essere prezioso per chiarire i meccanismi molecolari alla base di importazione di proteina in cloroplasti in dettaglio.
Importazione di proteine possa essere studiati utilizzando molti approcci diversi. Uno di questi metodi prevede l’utilizzo di un in vitro della proteina importazione sistema7,8. Utilizzando questo approccio, in vitro-tradotta proteine precursori vengono incubati con cloroplasti purificata in vitro, e importazione di proteina è analizzata da SDS-PAGE seguita da analisi western blot. Il vantaggio di questo approccio è che ogni passaggio dell’importazione di proteina in cloroplasti possa essere studiata in dettaglio. Pertanto, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per definire i componenti del macchinario molecolare della proteina importazione e dissezionare informazioni di sequenza per i peptidi di transito. Più recentemente, è stato sviluppato un altro approccio che coinvolge l’uso dei protoplasti da tessuti fogliari e si è diffuso per lo studio di proteine importazione in cloroplasti9,10. Il vantaggio di questo approccio è che i protoplasti forniscono un ambiente cellulare che è più vicino a quella di cellule intatte rispetto al sistema in vitro . Così, il sistema di protoplasti permette di affrontare molti altri aspetti di questo processo, come gli eventi associati citosolici e come viene determinata la specificità dei segnali di targeting. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l’uso dei protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l’uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis11,12 , che può ess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato effettuato con il supporto del programma di ricerca cooperativa per la scienza l’agricoltura e lo sviluppo della tecnologia (progetto n ° PJ010953012018), gestione dello sviluppo rurale e la concessione di National Research Foundation (Corea), finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2016R1E1A1A02922014), Repubblica di Corea.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
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