دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس
Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.
Abstract
بلاستيدات الخضراء هو عضية أساسية المسؤولة عن مختلف العمليات الخلوية في النباتات، مثل عملية التمثيل الضوئي وإنتاج العديد من نواتج الأيض الثانوية والدهون. المعايشة تتطلب عددا كبيرا من البروتينات لهذه العمليات الفسيولوجية المختلفة. أكثر من 95% بروتينات بلاستيدات الخضراء من ترميز نواة واستيرادها في الجبيلة من سيتوسول بعد الترجمة في ريبوسوم سيتوسوليك. وهكذا، استيراد السليم أو استهداف هذه البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء للمعايشة أمر أساسي للأداء السليم للمعايشة، فضلا عن الخلية النباتية. البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء تحتوي على تسلسلات إشارة لاستهداف محددة للمعايشة. الآلات الجزيئية مترجمة إلى بلاستيدات الخضراء أو سيتوسول تعترف بهذه الإشارات، والقيام بعملية الاستيراد. للتحقيق في آليات الاستيراد البروتين أو استهداف للمعايشة في فيفو، قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى جبلة مجردة سريعة وفعالة لتحليل البروتين استيراد المعايشة لنبات. في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم بروتوبلاستس المعزولة من أنسجة أوراق نبات. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس للتحقيق في الآلية التي يتم استيرادها البروتينات إلى المعايشة.
Introduction
بلاستيدات الخضراء واحدة من العضيات الأكثر أهمية في النباتات. واحدة من المهام الرئيسية للمعايشة القيام بعملية التمثيل الضوئي1. الجبيلة أيضا الاضطلاع بكثير من التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى لإنتاج الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية، النيوكليوتيدات ونواتج الأيض الثانوية العديدة1،2. لكل ردود الفعل هذه، تتطلب المعايشة عدد كبير من أنواع مختلفة من البروتينات. ومع ذلك، يتضمن الجينوم بلاستيدات الخضراء الجينات فقط حوالي 1003،4. ولذلك، يجب استيراد المعايشة غالبية البروتينات على من سيتوسول. في الواقع، قد أظهرت معظم بلاستيدات الخضراء البروتينات يتم استيراده من سيتوسول بعد الترجمة4،،من56. الخلايا النباتية تتطلب آليات محددة لاستيراد البروتينات من سيتوسول للمعايشة. ومع ذلك، على الرغم من أن هذه الآليات استيراد البروتين حققت على مدى عدة عقود، نحن لا تزال لا يفهمون تماما لهم على المستوى الجزيئي. هنا، نحن نقدم طريقة مفصلة لإعداد بروتوبلاستس ومناشئ التعبير عن الجينات في بروتوبلاستس. هذا الأسلوب يمكن أن يكون قيماً لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء استيراد البروتين المعايشة بالتفصيل.
يمكن دراسة البروتين الاستيراد باستخدام نهج مختلفة كثيرة. أحد هذه الأساليب ينطوي على استخدام في المختبر البروتين استيراد نظام7،8. باستخدام هذا النهج، في المختبر-السلائف البروتين المترجمة هي المحتضنة مع المعايشة المنقاة في المختبر، ويتم تحليل البروتين الاستيراد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تحليل لطخة غربية. وميزة هذا النهج أن كل خطوة من البروتين الاستيراد إلى المعايشة يمكن دراستها بالتفصيل. وهكذا، هذه الطريقة قد استخدمت على نطاق واسع لتحديد مكونات البروتين استيراد الأجهزة الجزيئية وتشريح معلومات تسلسل للعبور الببتيدات. في الآونة الأخيرة، تم وضع نهج آخر ينطوي على استخدام بروتوبلاستس من أنسجة نبات وأنها أصبحت تستخدم على نطاق واسع لدراسة البروتين استيراد الجبيلة9،10. وميزة هذا النهج هو أن بروتوبلاستس توفر بيئة خلوية التي أقرب إلى خلايا سليمة من النظام في المختبر . وبالتالي، النظام جبلة مجردة يسمح لنا بمعالجة العديد من جوانب هذه العملية، مثل أحداث سيتوسوليك المرتبطة بها وكيفية تحديد خصوصية استهداف إشارات إضافية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس لدراسة البروتين استيراد المعايشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمنا بروتوكول مفصلاً لاستخدام بروتوبلاستس نبات لدراسة البروتين استيراد المعايشة. هذا الأسلوب قوية للتحقيق في عملية الاستيراد البروتين. هذا الأسلوب البسيط، تنوعاً مفيد لدراسة استهداف البروتينات البضائع المقصود للمعايشة. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إعداد بروتوبلاستس من أنسجة أوراق …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نفذ هذا العمل بالدعم من “برنامج البحوث التعاونية” لعلوم الزراعة وتطوير التكنولوجيا (المشروع رقم PJ010953012018)، “إدارة التنمية الريفية”، ومنحة “مؤسسة البحوث الوطنية” (كوريا) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (رقم 2016R1E1A1A02922014)، جمهورية كوريا.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
