量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

RT qPCR による DENV RNA の定量化、同じプライマーによって検出することができます知られているコピー番号の標準セットは、前提条件であります。このプロトコルは、3 ‘UTR DENV 2 NGC ひずみのシーケンスは体外から T7 RNA 転写プロモーター融合 DENV 2 3′ を含む 462 塩基長の RNA の UTR DNA テンプレート PCR によって増幅されていたと精製 (図 2 aと2B). とき DENV RNA (5 x 109 10 μ L RT qPCR 反応で 5 × 102コピー) から直接 RT qPCR 分析に供した標準のシリアル 10 倍希釈使用 3′ UTR 固有のプライマーと、蛍光プローブ9、線形良い相関曲線 (R2 = 0.98726) (図 2) が得られました。 次に、この直接 RT qPCR アッセイは、ウイルス感染細胞の培養上清中 DENV を定量化に適用されました。DENV-2 (シンガポール分離 EDEN2 329510)、いた c6/36 蚊細胞に伝達されて、プラークアッセイ BHK 21 セル11を使用して滴定、(8 x 106 80 プラーク形成単位 [PFU]/mL) から順次希釈し。DENV サンプルいたし、ウイルス粒子を deproteinize にプロテイナーゼ K を含む処理バッファーの等量と扱われ、DENV 3′ UTR RNA シーケンスをターゲットと直接 RT qPCR 測定を受けます。再び、良い相関 (R2 = 0.99981) 蛍光信号が急増する背景には、上記の上昇ポイントと見なされますサイクル数 DENV 感染力価と Ct の間 (図 3 a) が得られました。既知の感染価と DENV 在庫のシリアル希薄化から生成された Ct 値は、標準曲線をプロットした時の in vitro転写 3′ UTR RNA 80 PFU/mL (8 x 103に等しい 8 × 106から得られるプロットのすべて10-2 PFU 10 μ L RT qPCR 反応 x 8) 標準的な RNA を受けるものの範囲内であった (図 3B10 μ L RT qPCR 反応のコピー 5 x 103 5 x 10 の9 )、DENV サンプル感染症の広い範囲を持つことを示す抗体は、この直接 RT qPCR を使用して、同時に分析できます。並列実験で RT qPCR によるバッファーまたはウイルス RNA の検出, プロテイナーゼ K 処理の処理の効果を調べた。ログ希釈 DENV サンプル (8 x 106 8 x 102 PFU/mL) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) RT-qPCR (PBS のウイルス サンプルの 1:1 希釈) し、25 ° C で 10 分間と 5 分の 75 ° C の孵化誘発前に単独での治療が、 回帰曲線 (図 3、黒線)、および PBS 治療によって得られる平均 Ct 値 2.6-3.2 サイクルが遅れたバッファー/プロテイナーゼ K 処理 (図 3点線) を処理することによって得られる Ct と比較した場合。さらに、この PBS 治療 (図 3) でウィルス (8 x 102 Pfu/ml 10-1 PFU 10 μ L RT qPCR 反応あたり x [8]) の最高の希釈を検出できませんでした。プロテイナーゼ K 処理バッファー処理 (図 3、グレー線) がない場合は、似たような回帰が生成されました。ただし、増幅の遅れ (0.1 – 0.8 サイクル), プロテイナーゼ K (図 3点線) を含む処理反応基準が認められました。これらのデータは、テスト条件の中で一緒にプロテイナーゼ K 処理バッファー DENV サンプルの治療は RT qPCR アッセイの感度を向上させること、示します。 直接 RT qPCR アッセイは、DENV に対する抗ウイルス剤の検証への適用性のためさらに評価されました。ミコフェノール酸 (MPA)、移植の免疫抑制剤として使用されるイノシン一リン酸脱水素酵素の非ヌクレオシド系阻害剤は、12,の in vitroDENV13を抑制する報告されています。以前の研究は、従来プラークアッセイまたは DENV 感染12,13MPA の抑制効果を発揮するウイルス抗原を検出する流れの cytometry 試金を採用が本研究で、直接 RT qPCRMPA の抗ウイルス活性の評価に適用されます。いた 5 x 10 の4細胞/ウェル 24 ウェル プレートでの密度で感染前に 1 日の播種されて、HeLa 細胞は 1 h の 1 の MOI で DENV 2 にさらされ、MPA (50 – 0.016 G/ml の存在下で DMEM/10% FBS での培養洗浄後、または 0.1% ジメチルスルホキシド [DMSO])。培養上清は感染 3 日後の収集され、DENV 3′ UTR 特異的プライマーおよび蛍光プローブを使用して直接 RT qPCR 測定を受けます。図 4は、MPA での in vitro転写 3′ UTR RNA 標準に定められた濃度の増加と感染細胞培養上清中 (反応) あたり DENV RNA のコピーを示します。50 μ g/mL (156 μ M) の治療と MPA、DMSO 治療文化の 99.87 ± 0.02% に減少が観察された (図 4)。重要なは、図 4に示すようにデータによって決まります MPA の IC50 (50% 抑制濃度) 値は 0.79 であった値に類似している μ M 報告12,13。この結果は、したがって、直接 RT qPCR 測定 DENV 感染に対する抗ウイルス剤の抑制効果を評価するために便利で信頼性の高い方法であることを示します。 最後に、他の RNA ウイルスに直接 RT qPCR 測定のアプリケーションがテストされました。YFV 17 D 特定のプライマーと、蛍光プローブとして14日の黄熱ウイルス (YFV) 17 D ワクチン株 (フラビ) していた Vero 細胞で増幅されて、bhk-21 細胞の滴定、株式 Rt-qpcr を使用して指示を受けたとき表 1に示す、ウイルス力価の Ct 値と良い直接的な相関関係をもつ標準曲線はウイルスの株式市場の 10 倍連続希釈で生成できる (3.2 × 105 3.2 PFU/ml、図 5 a)。同様に、直接チクングニア ウイルス (CHIKV,トガウイルス科) の RT qPCR 解析ロスひずみ株式、Vero 細胞で増幅されていたと CHIKV 特定のプライマーおよび蛍光プローブ15 (表 1) を使用して bhk-21 細胞の滴定感染価の間良い回帰を与えた (4.4 × 10 4.4 × 108 3 PFU/mL) と Ct 値 (図 5 b)。今回も反映されていたし、Vero 細胞、以前を使用して滴定する麻疹ウイルス (MeV、脱) のシリアル希釈 (8 x 102 8 x 10-2 PFU/mL、図 5) の検出のためのケース報告されたプライマーと蛍光プローブ16 (表 1)。これらのデータは、さまざまな RNA ウイルスの定量的検出のため直接 RT qPCR 法の適合性を示しています。 図 1: 直接 RT qPCR アッセイのワークフロー 。DENV 感染細胞培養上清は、ウイルス RNA (サンプル処理ステップ) を解放する, プロテイナーゼ K を含む処理バッファーで処理されます。加工サンプルは、ワンステップ RT-PCR 試薬と混合し、DENV 3′ UTR 固有プライマーと蛍光プローブを用いたリアルタイム PCR 法を受けます。それぞれのサンプルで検出されたウイルスの RNA のレベルは、希釈した標準によって決まります DENV RNA の転写の in vitroを使用して。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: DENV 3′ UTR RNA によって生成された標準的な曲線です。(A) 標準的な RNA の 3′ を含む DENV 2 NGC UTR 転写体外T7 RNA プロモーター シーケンス融合 PCR のフラグメントからだった。(B) 精製された DENV 3’ UTR RNA (250 ng) は 1% の agarose のゲル (右車線) に可視化しました。左車線は、RNA の電気泳動用分子量マーカーを示しています。(C) A ログ希釈 DENV 3 ‘UTR RNA 標準だったプロテイナーゼ K を含む処理バッファー処理し、ワンステップ RT qPCR 試薬と DENV 3 を用いたリアルタイム PCR 解析を受ける’ UTR 固有のプライマーと蛍光プローブ セット。平均 Ct 値 (n = 3) で得られたそれぞれの希釈液を 3′ UTR RNA の量に対してプロットした (10 μ L RT qPCR 反応で 5 × 109 5 x 102 RNA にコピー)。R2相関係数はあります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 直接 RT qPCR によるウイルス入荷 DENV RNA の定量化します。C6/36 細胞で生産高価 DENV 2 (A) 在庫は 10 倍希釈した直列 (8 x 106 8 x 101 PFU/mL) DMEM/10% FBS と RNase 阻害剤を含む、DENV 3′ UTR 特異プライマーを使用して直接 RT qPCR 測定を受ける/probe。ログ希釈 DENV 株式 (円) の RT qPCR による (B) Ct 値をプロットした転写 3′ UTR RNA (三角形) の標準曲線体外。8 × 106 Pfu/ml 株式直接 RT qPCR アッセイでの使用は、RT qPCR 反応 8 x 103 10 μ L でウイルスの PFU に対応します。(C) このパネルは、バッファーとウイルス RNA の検出, プロテイナーゼ K 処理の処理の効果を示しています。プロティナーゼ K (白丸) 処理バッファーだけで (灰色円)、または PBS (黒い円) と、直接に受けるを含む処理バッファーの等量だったインキュベートを希釈 DENV ストック (8 x 106 8 x 102 PFU/mL)RT qPCR の試金。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 直接 RT qPCR による MPA の抑制効果の評価します。HeLa 細胞は、1 MPA、DENV (または 0.1 %dmso) 以前に報告した阻害剤濃度の増加の存在下で培養の MOI で DENV 2 に感染していた。3 日後に感染症、感染細胞培養上清に収集され DENV 3′ UTR 固有プライマー ・ プローブを使用して直接 RT qPCR 測定を受けます。ウイルスの RNA のコピー数がによって決まります DENV 3′ UTR RNA 転写の体外標準。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 直接 Rt-qpcr 他の RNA ウイルスの検出のためのアプリケーション。YFV (A)、(B) CHIKV (C) MeV の希釈したウイルス株は PCR のプライマーを使用して直接 RT qPCR 法, 蛍光発生プローブのそれぞれのウイルス RNA シーケンスに固有。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 目的 名 シーケンス (5′ 3′) メモ T7 プロモーター融合 DENV 2 3’UTR cDNA 増幅 T7 DENV 3′ UTR Fwd TAA TAC GAC TCA CTA タグ GGc gaa tTA GAA GGC 法 AAC ATG AAA 斜体、T7 プロモーター。小文字、スペーサー。太字、DENV 2 NGC ヌクレオチド 10,270 10,292 DENV 3′ UTR rv 車 AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC DENV 2 NGC ヌクレオチド 10,723 10,703 RT qPCR DENV の分析 DENV 2 3′ UTR F AAG GAC タグ AGG はったギャグ ギャグ ACC C 参照 9 DENV 2 3′ UTR R GGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG プローブ 2 デン-2-4 6FAM AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-タムラ RT qPCR YFV の分析 YFV NS5 F GAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT 参考 14 YFV NS5 R GGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G YFV NS5 プローブ 6FAM CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-タムラ CHIKV の RT qPCR 解析 チク E1 F TCG ACG シージーシー CCT CTT TAA 参考 15 チク E1 R ATC GAA TGC ACC GCA CAC T チク E1 P 6FAM ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-タムラ RT qPCR による MeV MeV N F TGG 猫 CTG AAC TCG GTA TCA C 参照 16 MeV N R TGT CCT CAG タグ TAT GCA TTG CAA MeV N P 6FAM CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-タムラ 表 1: オリゴヌクレオチドのプライマーおよび蛍光プローブ本研究で使用されるシーケンスです。 コンポーネント ストック濃度 ボリューム (μ L) 最終濃度 PrimeSTAR Max プレミックス 2 x 25 1 x T7 DENV 3′ UTR Fwd 1 Μ M 10 200 nM DENV 3′ UTR rv 車 1 Μ M 10 200 nM pEU/DENV 3 ‘ UTR 1 ng/μ l 1 20 pg/μ l ヌクレアーゼ フリー H2O 4 合計 50 表 2: DENV 3′ UTR テンプレート DNA の準備のため PCR のコンポーネントを混在させます。 コンポーネント ストック濃度 ボリューム (μ L) 最終濃度 T7 シーケンス融合 DENV 3′ UTR の DNA のテンプレート (変数) x 100 ng の反応あたり ATP ソリューション 75 mM 2 7.5 mM CTP ソリューション 75 mM 2 7.5 mM GTP ソリューション 75 mM 2 7.5 mM UTP ソリューション 75 mM 2 7.5 mM 反応バッファー 10 倍 2 1 x T7 酵素ミックス 2 組換え RNase 阻害剤 40 単位/μ l 1 2 単位/μ l ヌクレアーゼ フリー H2O 7-x 合計 20 表 3: 標準 DENV 3′ UTR RNA を合成するため、IVT のコンポーネントを混在させます。 コンポーネント ストック濃度 ボリューム (μ L) RT qPCR 反応の最終濃度 iTaq ユニバーサル プローブ反応混合物 2 x 5.00 1 x iScript 逆転写酵素を高度な 40 倍 0.25 100 ng の反応あたり プライマー ・ プローブ ミックス DENV 2 3′ UTR F: 3 Μ M 1.00 300 nM DENV 2 3’ UTR R: 3 Μ M 300 nM プローブ 2 デン-2-4:2 μ M 200 nM ヌクレアーゼ フリー H2O 1.75 小計を表示します。 8.00 表 4: DENV RNA のリアルタイム Rt-qpcr 分析用マスター ミックスのコンポーネント。注意してください 2 μ L 加工 DENV サンプル (または標準的な RNA) の 8 μ L マスター ミックス (10 μ L 反応あたりの合計) に追加してください。