JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

Published: November 01, 2018
doi:
10.3791/58407
, , , , ,
1Department of Microbiology and Infection Control,Osaka Medical College

Summary

تحليل سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع النسخ العكسي (RT-قبكر) وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس مستوى الإصابة بفيروسات الرنا. نقدم هنا مقايسة RT-qPCR مباشرة، التي لا تتطلب خطوة تنقية الحمض النووي الريبي، وضعت للتحديد الكمي للعديد من الفيروسات الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك فيروس حمى الدنج.

Abstract

وفي الوقت الحاضر، بوليميراز في الوقت الحقيقي التفاعل المتسلسل (PCR) التكنولوجيا أداة لا غنى عنها للكشف والتحديد الكمي للجينوم الفيروسي في مختبرات البحوث، وكذلك للتشخيص الجزيئي، بسبب حساسيتها، خصوصية، و الراحة. ومع ذلك، في معظم الحالات، تحليل PCR (qPCR) الكمية تستخدم عادة للكشف عن الإصابة بالفيروس وقد اعتمدت على تنقية الحمض النووي الفيروسي قبل الخطوة PCR. في هذه الدراسة، يوضع الإنزيم qPCR (RT-qPCR) النسخ العكسي القائم على الأسفار من خلال الجمع بين معالجة المخزن مؤقت وكاشف RT-PCR خطوة واحدة حيث أن كل عملية، من الحصاد من المادة طافية الثقافة للمصابين بالفيروس الخلايا حتى الكشف في الوقت الحقيقي، يمكن أن يؤديها دون تنقية الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. ويتيح البروتوكول المعمول التحديد الكمي لتركيزات طائفة واسعة من الجيش الملكي النيبالي فيروس حمى الضنك (DENV) في 90 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، يتجلى تكيف الإنزيم RT qPCR مباشرة لتقييم وكيل المضادة للفيروسات بتجربة في المختبر باستخدام مثبط DENV سبق الإبلاغ عنها، حمض ميكوفينوليك (الآلام والكروب الذهنية). وعلاوة على ذلك، يمكن قياسها كمياً فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى، بما في ذلك فيروس الحمى الصفراء (يفف) وفيروس الشيكونغونيا (تشيكف) وفيروس الحصبة (مليون إلكترون فولط)، قبل qPCR RT مباشرة مع البروتوكول نفسه. ولذلك الإنزيم RT qPCR المباشرة الموصوفة في هذا التقرير مفيدة لمراقبة النسخ المتماثل فيروسات الرنا بطريقة بسيطة وسريعة، وستوضع كذلك إلى منصة واعدة لدراسة الفرز الفائق والتشخيص السريري.

Introduction

جنس مصفر من عائلة فيروسات مصفرة تضم أكثر من 70 يلفها، فيروسات الرنا إيجابية-الذين تقطعت بهم السبل التي هي المنقولة بواسطة البعوض والقراد. الأهم من ذلك، والعدوى مصفر في البشر غالباً ما يؤدي إلى المرض السريرية الشديدة، مثل التهاب الدماغ والحمى النزفية1. وفي الواقع، تفشي الفيروس Zika (زيكف)، مصفر، مؤخرا انتشر الفلزي في جميع أنحاء الأمريكتين وقد ثبت أن تترافق مع المضاعفات العصبية، بما في ذلك صغر الرأس2،3. Flaviviruses، وبالتالي، أثر كبير السريرية والاقتصادية في المجتمع الحديث.

مصفر مهم فيروس حمى الدنج (DENV)، أحد فيروسات المنقولة بالبعوض وزعت على نطاق واسع في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية من العالم. DENV يحيل بعوضة البعوض، بما في ذلك Aedes albopictus و بعوض الزاعجة المصرية، أدى إلى انتشار حالات تفشي حمى الضنك4على الصعيد العالمي. حاليا، ومنظمة الصحة العالمية (WHO) يصنف مرض حمى الضنك كثلاث فئات: حمى الضنك دون علامات التحذير، وحمى الضنك مع علامات التحذير، وحمى الضنك الشديد4. على الرغم من أن العدوى الأولية مع واحدة من اللقاح أربعة من DENV (DENV-1 إلى-4) غالباً غير متناظرة أو المقيدة ذاتيا، وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن العدوى الثانوية للقاح مختلفة يزيد خطر الإصابة بأشكال أكثر خطورة من حمى الضنك. تجدر الإشارة إلى أن تعزيز تعتمد على جسم DENV العدوى الناجمة عن عدم أو سوبنيوتراليزينج الأجسام المضادة التي أنتجها خلال الإصابة الأولية قد اقترح كآلية محتملة للضنك الشديد الذي حدث كالعدوى الثانوية. لا من العقاقير المضادة للفيروسات المحددة غير متوفرة ل الإصابة DENV5.

لتطوير العوامل المضادة للفيروسات ضد DENV، الروتين وفحوصات قوية، وقابلة لإعداد الفائق، ضرورية للكشف عن النسخ المتماثل الفيروس كمياً. تقليديا، فحوصات بيولوجية (مثلاً، تحليل اللوحة) للتحديد الكمي للفيروسات المعدية وفحوصات مناعية (مثلاً، المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم [أليسا]) للكشف عن المستضدات الفيروسية قد استخدمت لرصد DENV النسخ المتماثل في المختبر و في فيفو6،7. ومع ذلك، هذه الاختبارات غالباً ما تكون شاقة ويتطلب عدة أيام لإنجاز، مما يعوق التعامل مع عدد كبير من العينات. وفي هذا الصدد، RT qPCR مقايسة موثوق بها للكشف عن الإصابة DENV: أنها محددة وحساسة وسريعة نسبيا7. وبالإضافة إلى ذلك، قد تقنية RT qPCR المزيد من المزايا في شكل الفائق. ومع ذلك، الإجراء النموذجي ل RT-PCR لفيروسات الرنا يطالب باسترداد الأحماض النووية الفيروسية من العينات التي تم جمعها. على الرغم من أن يمكن استخدام مختلف أساليب الاستخراج RT-قبكر، يزال يلزم خطوات متعددة للحصول على الحمض النووي الريبي الفيروسية المنقاة. أيضا، تتطلب فحوصات RT qPCR عادة أعمدة الدوران مكلفة أو المذيبات العضوية الخطرة، مما يجعل عملية إعداد أكثر تعقيداً. نظراً لتجنب سوء و/أو التلوث المتبادل بين العينات عامل حاسم لنجاح التحديد الكمي للجينوم الفيروسي، أسلوب أقل شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً المفضل، لا سيما إذا كان RT-qPCR ليتم تطبيقها على تنسيق الفائق.

هنا، نحن تقرير إجراء الرايت قبكر بسيطة لقياس الحمض النووي الريبي DENV في المادة طافية ثقافة من الخلايا المصابة لا تنطوي على تنقية الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. هذا البروتوكول RT-قبكر الأمثل ويتألف من خطوتين: ط) الحضانة للمادة طافية ثقافة الخلية المصابة DENV مع معالجة المخزن المؤقت، وثانيا) خطوة واحدة RT-قبكر على صك PCR الوقت الحقيقي. وبناء على ذلك، يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي DENV في ثقافة طافية داخل 90 دقيقة (الشكل 1). ونحن أيضا وصف تطبيق RT-قبكر المباشر لعدوى فيروس الحمض النووي الريبي الأخرى.

Protocol

1-إعداد قالب الحمض النووي لمستوى الحمض النووي الريبي إعداد بكر ميكس (إجمالي حجم 50 ميكروليتر، الجدول 1) باستخدام ناقلات بلازميد الحمض النووي الذي يحتوي على DENV-2 (ج) غينيا الجديدة (NGC، انضمام عدد: AF038403.1) 3 ‘أهمل المنطقة (3’ UTR)8 والإشعال (T7-DENV 3 ‘الموجه إليه UTR و DENV 3’ رفس UTR) في أنبوب 0.2 مل، كما المبينة في الجدول 2.ملاحظة: هذه الخطوة التي ستجري تحت غطاء محرك السيارة نظيفة (أو في غرفة نظيفة) لتجنب تلوث أي من المنتجات ذات الصلة أمبليكون. تضخيم PCR كدنا T7 تسلسل تنصهر DENV 3 ‘ UTR في ثيرموسيكلير، استخدام الشروط التالية: دورات 30 (98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 55 درجة مئوية 5 s، و 72 درجة مئوية ل 5 s). مزيج تفاعل PCR مع 10 ميكروليتر 6 × صبغ هلام-تحميل وتحميل على 1% [اغروس] هلام مع الحمض النووي جزيئي سلم تتراوح من 0.1 إلى 10 كيلوبس أزواج (kbp). تصور المنتج بكر (479 زوج قاعدي [بي بي]) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الطويلة-الطول الموجي باستخدام أسلوب تصور الحمض النووي وهلام نظام التصوير. قطع الفرقة الحمض النووي باستخدام مشرط نظيف. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي (جدول المواد).ملاحظة: يمكن إجراء هذه الخطوة تنقية خارج غطاء محرك السيارة نظيفة، ولكن من الضروري للحفاظ على بيئة نظيفة خلال عملية لتفادي التلوث رناسي، ومشكلة رئيسية في الجيش الملكي النيبالي DENV التوليف القياسية الخطوات التالية. وزن الشريحة جل وإضافة 100 ميكروليتر من مخزن الالتقاط المؤقت كل 100 مغ شريحة جل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. حل الجل بالحضانة عند 60 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة. تجميع عمود تنقية الحمض النووي مع أنبوب جمع ونقل 600 ميكروليتر من عينة المذاب إلى العمود بتنقية. الطرد المركزي في 16,000 س ز 30 ثانية وتجاهل التدفق من خلال. إذا كان حجم العينة أكبر من 600 ميكروليتر، تطبيق بقية العينة إلى العمود تنقية الحمض النووي بعد الدوران الأول وكرر هذه الخطوة. تطبيق 500 ميكروليتر من الغسيل المخزن المؤقت إلى العمود تنقية الحمض النووي. أجهزة الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 30 ثانية. مكان العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. إضافة 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت شطف واحتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة الوت الحمض النووي. قياس الكثافة الضوئية للحمض النووي في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي استخدام 3 ميكروليتر من عينة التيد. استخدام نفس حجم المخزن المؤقت شطف كقرص فارغ.ملاحظة: يمكن تخزين القالب الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. 2-تجميع DENV 3 ‘ UTR الحمض النووي الريبي القياسية ملاحظة: الحفاظ على ريبونوكليسي (رناسي)-بيئة خالية قدر الإمكان لتنفيذ الخطوات التالية. ينبغي أن يجري تركيب الكاشف داخل غطاء نظيفة، باستخدام بيبيتس نوكلاس خالية ونصائح وأنابيب. خلط في المختبر النسخ (IVT) رد فعل (إجمالي حجم 20 ميكروليتر) مع 100 نانوغرام رنا T7 المروج تنصهر فيها تسلسل DENV 3 ‘ الحمض النووي UTR قالب (من الخطوة 1، 6) في أنبوب بكر 0.2 مل كما هو موضح في الجدول 3. احتضان المخلوط في 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير ح 2. إضافة 1 ميكروليتر من الدناز إلى رد فعل IVT وتستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تنقية في المختبر نسخها من الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد). إضافة 80 ميكروليتر خالية رناسي ح2س و 350 ميكروليتر من مخزن الالتقاط المؤقت، بما في ذلك 1% β-ميركابتوثانول. إضافة 250 ميكروليتر من الإيثانول 100% إلى رد فعل IVT وأنها مزيج جيد من قبل بيبيتينج. تجميع عمود تنقية الحمض النووي الريبي مع أنبوب جمع ونقل عينات الحمض النووي الريبي لتنقية العمود. الطرد المركزي من مبلغ 000 8 × ز 15 s وتجاهل التدفق من خلال. تطبيق 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للغسيل لتنقية الحمض النووي الريبي العمود والطرد المركزي أنه في 8,000 س ز 2 دقيقة. مكان العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 50 ميكروليتر من خالية رناسي ح2س واحتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. الطرد المركزي أنه في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة الوت الجيش الملكي النيبالي. قياس الكثافة الضوئية للجيش الملكي النيبالي في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي، استخدام 3 ميكروليتر من عينة التيد. استخدم نفس الحجم من ح2س كقرص فارغ. تحديد عدد النسخ المركبة DENV 3 ‘ UTR الجيش الملكي النيبالي. 1 نانوغرام من DENV 3 ‘ UTR الحمض النووي الريبي (462 من القواعد، الشكل 2) قابل للمقارنة إلى 4.05 × 109 نسخ. تخزين مستوى الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. 3-تجهيز عينات الفيروس ل RT-قبكر ملاحظة: الخطوات 3.1 – 3.3 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء سلامة بيولوجية. على وجه الخصوص، يجب أن تتم معالجة المادة طافية الثقافة التي تحتوي على فيروسات معدية تحت بيئة السلامة الأحيائية مستوى 2 (أو أعلى). ميكروليتر ميكس 199 معالجة المخزن مؤقت و 1 ميكروليتر من البروتيناز خالية نوكلاس ك. متسلسل تمييع المركب DENV 3 ‘ UTR الجيش الملكي النيبالي (من الخطوة 2، 6) 01:10 للحصول على 5 × 109 إلى 5 × 103 نسخ/ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي باستخدام معيار خلية الثقافة المتوسطة (مثلاً، دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والمضادات الحيوية [DMEM/10% FBS]) يحتوي على 40 وحدة/مل رناسي المانع. ميكروليتر 5 مزيج من المادة طافية ثقافة الخلايا المصابة DENV ومعيار DENV 3 ‘ رنا UTR مع 5 ميكروليتر من معالجة المخزن المؤقت/بروتيناز ك الحل (من الخطوة 3.1) باستخدام شرائط بكر 8-أنبوب أو لوحة بكر 96-جيدا. كعنصر تحكم غير القالب (المجلس الوطني الانتقالي)، مزيج 5 ميكروليتر من خلية الثقافة المتوسطة (أي، يتم تضمين أي فيروس) مع 5 ميكروليتر من الحل معالجة المخزن المؤقت/بروتيناز ك. وبعد الطرد المركزي موجزة، احتضان العينات في ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: 1 دورة (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).ملاحظة: يمكن الاحتفاظ العينات المجهزة في 4 درجات مئوية إذا كان يتم تحليل PCR الوقت الحقيقي في نفس اليوم. للتخزين على المدى الطويل، يجب تخزين العينات في-80 درجة مئوية. 4. تحليل PCR في الوقت الحقيقي ملاحظة: ينصح بإجراء خطوات 4.1 – 4.4 داخل غطاء نظيفة لتقليل التلوث من أي المنتجات ذات الصلة amplicon أو رناسي. إعداد مزيج رئيسي الرايت قبكر مع كاشف RT-PCR خطوة واحدة (جدول المواد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل (رناسي الحرة) باستخدام DENV 3 ‘ محددة UTR الإشعال وتحقيق فلوروجينيك (الجداول 1). مضاعفة حجم كل مكون (الجدول 4) ذكرت 11% أكثر من العدد الكلي للعينات، بما في ذلك ردود فعل الجيش الملكي النيبالي، والمجلس الوطني الانتقالي القياسية. اليكووت 8 ميكروليتر من مزيج الرئيسي في البئر لاستخدامها في صفيحة بكر 96-جيدا في الوقت الحقيقي (جدول المواد). بإيجاز، الطرد المركزي العينات المجهزة، بما في ذلك معيار DENV 3 ‘ UTR الجيش الملكي النيبالي، والمجلس الوطني الانتقالي (من الخطوة 3، 4) وإضافة 2 ميكروليتر من العينات لكل بئر من لوحة بكر 96-جيدا في الوقت الحقيقي. إغلاق لوحة بكر مع الفيلم لاصقة بصريا واضحة. الطرد المركزي باختصار اللوحة في 200 x ز لإزالة فقاعات الهواء. ضع اللوحة في صك PCR الوقت الحقيقي ودورة اللوحة باستخدام الشروط التالية: 1 دورة RT المرحلة (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق)، دورة 1 من مرحلة تنشيط بوليميراز (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، دورات 40 مرحلة التضخيم (95 درجة مئوية ل 10 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 s [واحد الحصول على البيانات في هذه الخطوة]). تحديد عدد النسخ من الجيش الملكي النيبالي DENV في العينات باستخدام برمجيات المرتبطة ببكر في الوقت الحقيقي. في إطار الإعداد ، قم بتعيين من رد فعل ليتم تحليلها كنموذج غير معروف جيدا. تعيين بئر متسلسل المخفف DENV 3 ‘ UTR الجيش الملكي النيبالي معيار ، واكتب عدد النسخ المتوقع لمستوى الحمض النووي الريبي في كل بئر (مثلاً، إذا استخدمت 5 × 103 نسخ/ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي الحل القياسية، اكتب 5,000). تعيين جيدا مراقبة سلبية للمجلس الوطني الانتقالي. في إطار تحليل ، انقر فوق تحليل ، وتأكد من أن معامل الارتباط (ص2) المنحنى القياسي ولدت يساوي أو أكبر من 0.98. عموما، استخدام الإعدادات الافتراضية Ct (عتبة: السيارات، الأساس بدء دورة: السيارات، ودورة نهاية خط الأساس: السيارات) للتحليل.ملاحظة: عدد العينات غير معروف نسخة تلقائياً تحسب على أساس قيم العتبة دورة (Ct) من ردود الفعل الفردية. يعتبر عدد نسخ المحسوبة لكل عينة من نسخ الحمض النووي الريبي لكل 10 ميكروليتر RT qPCR رد فعل (مثلاً، إذا كان 12,345 هو المشار إليه في نموذج غير معروف ، وهذا يعني أن نسخ 12,345 من الجيش الملكي النيبالي DENV موجودة في رد فعل).

Representative Results

للتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي DENV بتحليل RT-قبكر، معياراً لعدد النسخ المعروفة، التي يمكن الكشف عنها بواسطة التمهيدي نفس مجموعة، هو شرط أساسي. في هذا البروتوكول، 462 الجيش الملكي النيبالي النوكليوتيدات طوله المتضمن في 3 ‘تسلسل UTR سلالة NGC DENV 2 كان في المختبر نسخها من الجيش الملكي النيبالي T7 المروج تنصهر 3 DENV 2’ قالب UTR الحمض النووي، الذي تم تضخيمه عن طريق PCR وتنقيته (الشكل 2A و 2B). عند إضعاف إذ التسلسلية القياسية DENV الحمض النووي الريبي (من 5 × 109 إلى 5 × 102 نسخ في رد فعل RT qPCR 10 ميكروليتر) تعرضت لإجراء تحليل قبكر RT مباشرة استخدام 3 ‘ كبسولة تفجير UTR محددة وفلوروجينيك التحقيق9، خطي منحنى مع معامل الارتباط جيد (ص2 = 0.98726) وتم الحصول على (الشكل 2). بعد ذلك، تم تطبيق هذا الإنزيم RT qPCR مباشرة كمياً DENV في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بالفيروس. وكان المخفف DENV 2 (سنغافورة عزل EDEN2 329510)، التي تم نشرها في خلايا البعوضة C6/36 ومعاير بمقايسة اللوحة باستخدام خلايا BHK-2111، متسلسل (من 8 × 106 إلى اللوحة 80 تشكيل وحدات [بفو]/mL). عينات DENV ثم تعامل مع تساوي حجم معالجة المخزن المؤقت الذي يحتوي على بروتيناز ك ديبروتينيزي فيريونس وتعرض مقايسة RT-قبكر مباشر استهداف DENV 3 ‘ تسلسل الحمض النووي الريبي UTR. ومرة أخرى، علاقة جيدة (ص2 = 0.99981) بين عيار المعدية DENV والتصوير المقطعي عدد دورة أن يعتبر أن هذه النقطة حيث ترتفع إشارة الفلورسنت مع النمو الهائل فوق الخلفية، تم الحصول على (الشكل 3A). عندما Ct القيم التي تم إنشاؤها من مسلسل إضعاف الأسهم DENV مع التتر المعدية المعروفة تم رسمها على المنحنى القياسي في المختبر نسخها UTR الجيش الملكي النيبالي، جميع المؤامرات التي تم الحصول عليها من 8 × 106 إلى 80 بفو/مليلتر (ما يعادل 8 × 103 إلى 3 ‘ 8 × 10-2 بفو في رد فعل RT qPCR 10 ميكروليتر) كانوا ضمن المجموعة من الذين تعرضوا للجيش الملكي النيبالي القياسية (5 × 109 إلى 5 × 103 نسخ في رد فعل RT qPCR 10 ميكروليتر، الشكل 3)، مما يشير إلى أن DENV عينات مع مجموعة واسعة من المعدية يمكن تحليل التتر في الوقت نفسه، استخدام هذا قبكر-RT مباشرة. في تجارب موازية، كان التحقيق في تأثير معالجة المخزن المؤقت أو العلاج بروتيناز ك في الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسية بتحليل RT-قبكر. على الرغم من أن علاج إضعاف سجل DENV العينة (8 × 106 إلى 8 × 102 بفو/مل) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وحدها قبل RT-قبكر (1:1 تمييع عينة فيروس مع برنامج تلفزيوني) وحضانة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وأثارت انحدار منحنى (الشكل 3، الخط الأسود)، والقيم المقطعية يعني الحصول على علاجهم في برنامج تلفزيوني تأخرت دورات 2.6 – 3.2 بالمقارنة مع الأشعة المقطعية التي حصل عليها تجهيز معاملة المخزن المؤقت/بروتيناز ك (الشكل 3، الخط المنقط). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن لا يتم الكشف عن إضعاف أعلى من الفيروس (8 × 102 بفو/مل [8 × 10-1 بفو الواحدة 10 ميكروليتر RT qPCR رد فعل]) مع هذا العلاج PBS (الشكل 3). في غياب بروتيناز ك أثناء معالجة المخزن المؤقت لتجهيز (الخطرقم 3، رمادي)، ولدت انحدار مماثلة؛ ومع ذلك، التأخير في التضخيم (0.1-0.8 دورات) لوحظ ما زالت بالنسبة لتجهيز رد فعل يتضمن بروتيناز ك (الشكل 3، الخط المنقط). هذه البيانات تشير إلى أنه، بين الشروط التي اختبرت، يتحسن علاج العينة DENV مع معالجة المخزن المؤقت إلى جانب بروتيناز ك حساسية المقايسة RT-قبكر. كذلك تم تقييم الإنزيم RT qPCR مباشرة لانطباقه على التحقق من العوامل المضادة للفيروسات ضد DENV. حمض ميكوفينوليك (الآلام والكروب الذهنية)، مثبط نونوكليوسيدي من نازعة الأدينوزين إينوسيني الذي يتم استخدامه كالمناعة في زرع الأعضاء، أبلغ أن تكبح DENV في المختبر12،13. على الرغم من أن الدراسات السابقة التي استخدمت مقايسة لوحة تقليدية أو مقايسة تدفق الخلوي لاكتشاف مولدات المضادات الفيروسية لإظهار تأثير المثبطة للآلام والكروب الذهنية على DENV العدوى12،13، في هذه الدراسة، كان qPCR RT مباشرة تطبيق لتقييم النشاط المضاد للفيروسات للآلام والكروب الذهنية. خلايا هيلا، التي قد تم تبذر في كثافة من 5 × 104 خلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا يوم 1 قبل الإصابة، قد تعرضت ل DENV-2 في وزارة الداخلية من 1 لح 1، وبعد الغسيل، مثقف مع DMEM/10% FBS حضور 50 – 0.016 ميكروغرام/مل (الآلام والكروب الذهنية أو 0.1% ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]]). ثقافة طافية جمعت 3 أيام بعد الإصابة وتعرض للمقايسة RT-qPCR مباشرة باستخدام DENV 3 ‘ محددة UTR الإشعال وتحقيق فلورسنت. ويبين الشكل 4 نسخ الحمض النووي الريبي DENV (كل فعل) في supernatants ثقافة من الخلايا المصابة تعامل مع زيادة تركيزات من الآلام والكروب الذهنية، التي تم تحديدها بواسطة في المختبر نسخها 3 ‘ المعيار UTR الجيش الملكي النيبالي. مع علاج من 50 ميكروغرام/مل (156 ميكرومتر) الآلام والكروب الذهنية، لوحظ انخفاض إلى 99.87 ± 0.02% من ثقافة مراقبة معاملة [دمس] (الشكل 4). الأهم من ذلك، كانت قيمة50 (50% تركيز المثبطة) IC للآلام والكروب الذهنية يحددها البيانات المبينة في الشكل 4 0.79 ميكرومتر، ومماثلة للقيم التي ذكرت سابقا12،13. هذه النتيجة، لذلك، يشير إلى هذا الإنزيم RT qPCR مباشرة طريقة مفيدة وموثوق بها لتقييم تأثير المثبطة للعوامل المضادة للفيروسات في الإصابة DENV. وأخيراً، تم اختبار التطبيقات للانزيم قبكر RT مباشرة إلى غيره من فيروسات الرنا. عندما تعرض بمخزون من الحمى الصفراء فيروس (يفف) د 17 سلالة اللقاح (فيروسات مصفرة)، الذي تم تضخيمه في الخلايا فيرو ومعاير على الخلايا BHK-21، لتوجيه استخدام الرايت qPCR يفف-د 17-خاصة بأجهزة الإشعال وفلوروجينيك التحقيق14، المبينة في الجدول 1، منحنى قياسي مع جيدة الارتباط المباشر بين التتر الفيروسات والقيم المقطعية يمكن أن تتولد مع الوقت إضعاف مسلسل من مخزون فيروس (3.2 × 105 إلى 3.2 بفو/mL، الشكل 5A). وبالمثل، توجيه تحليل RT-qPCR لفيروس شيكونغونيا (تشيكف، توجافيريداي) روس سلالة الأسهم، التي قد تم تضخيمه في الخلايا فيرو ومعاير على الخلايا BHK-21، استخدام الإشعال الخاصة تشيكف وفلوروجينيك تحقيق15 (الجدول 1)، أعطى انحدار جيدة بين التتر المعدية (4.4 × 108 إلى 4، 4 × 103 بفو/mL) وقيم Ct (الشكل 5 (ب)). هذا هو الحال أيضا للكشف عن إضعاف المسلسل (8 × 102 إلى 8 × 10-2 مليلتر بفو، الرقم 5) فيروس الحصبة (مليون إلكترون فولط، Paramyxoviridae) التي تم نشرها ومعاير مع الخلايا فيرو، مسبقاً باستخدام كبسولة تفجير تم الإبلاغ عنها و تحقيق فلوروجينيك16 (الجدول 1). تظهر هذه البيانات تكيف الإنزيم RT qPCR مباشرة للكشف عن فيروسات الرنا المختلفة الكمية. رقم 1: سير العمل للانزيم قبكر RT مباشرة- المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة DENV تعامل مع المخزن مؤقت معالجة تتضمن بروتيناز ك بالإفراج عن الرنا الفيروسي (خطوة تجهيز العينة). ثم العينة المجهزة مختلطة مع كاشف RT-PCR خطوة واحدة وتخضع للتحليل PCR في الوقت الحقيقي باستخدام DENV 3 ‘ محددة UTR الإشعال وتحقيق فلوروجينيك. يمكن تحديد مستويات الرنا الفيروسي اكتشف في عينات منها بواسطة معيار مخفف متسلسل في المختبر باستخدام تدوين DENV الجيش الملكي النيبالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2: منحنى قياسية التي تم إنشاؤها بواسطة رنا DENV 3 ‘ UTR. (A) القياسية من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على 3 ‘ UTR NGC DENV 2 كان يدون في المختبر من الحمض النووي الريبي T7 مروج تنصهر فيها تسلسل بكر جزء. (ب) منقي DENV 3 ‘ UTR الحمض النووي الريبي (250 نانوغرام) كانت تصور على 1% [اغروس] هلام (الممر الأيمن). الممر الأيسر يظهر علامة الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي التفريد. (ج) سجل تمييع الإشعال الخاصة UTR DENV 3 ‘كان تعامل مع تجهيز المخزن المؤقت الذي يحتوي على بروتيناز ك معيار UTR الجيش الملكي النيبالي وتعرض لإجراء تحليل PCR في الوقت الحقيقي باستخدام كاشف الرايت قبكر خطوة واحدة و DENV 3’ ومجموعة تحقيق فلوروجينيك. القيم المقطعية يعني (n = 3) التي تم الحصول عليها في تخفيف كل منهما كانت تآمرت ضد الكمية المقدرة من 3 ‘ UTR الحمض النووي الريبي (5 × 109 إلى 5 × 102 الجيش الملكي النيبالي بنسخ في رد فعل RT qPCR 10 ميكروليتر). R2 هو معامل الارتباط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي DENV الأسهم الفيروس قبل مباشرة RT-قبكر- كان متسلسل تضعف الأسهم (أ) ارتفاع عيار DENV-2 تنتج في الخلايا C6/36 10 إضعاف (8 × 106 إلى 8 × 101 بفو/مل) مع DMEM/10% FBS التي تحتوي على مثبطات رناسي وتعرض للمقايسة RT qPCR مباشرة استخدام DENV 3 ‘ محددة UTR الإشعال /probe. (ب) Ct القيم التي حصلت عليها RT-qPCR DENV المخفف سجل المخزون (الدوائر) كانت المرسومة على منحنى قياسي من 3 ‘ UTR الجيش الملكي النيبالي (مثلثات) نسخها في المختبر. يناظر استخدام الأسهم بفو/مل في مقايسة RT qPCR مباشرة 8 × 106 8 × 103 بفو للفيروس في 10 ميكروليتر RT qPCR رد فعل. (ج) هذا الفريق يظهر تأثير معالجة المخزن المؤقت والعلاجات بروتيناز ك في الكشف عن الرنا الفيروسي. وكان المحتضنة DENV تضعف الأسهم (8 × 106 إلى 8 × 102 بفو/mL) مع حجم متساو لتجهيز مخزن يحتوي على بروتيناز ك (دوائر بيضاء)، معالجة المخزن المؤقت لوحدها (دوائر رمادية)، أو برنامج تلفزيوني (دوائر سوداء) وتعرض بعد ذلك للمباشرة RT-qPCR المقايسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4: تقييم لتأثير المثبطة للآلام والكروب الذهنية التي qPCR RT مباشرة- كانوا مصابين بخلايا هيلا DENV-2 في وزارة الداخلية 1 ومثقف حضور التركيزات المتزايدة للآلام والكروب الذهنية، مثبط تم الإبلاغ عنها سابقا من DENV (أو [دمس] 0.1%). ثلاثة أيام بعد الإصابة، جمعت supernatants ثقافة الخلايا المصابة وتعرض للمقايسة RT qPCR مباشرة استخدام DENV 3 ‘ محددة UTR الإشعال/التحقيق. عدد نسخ الرنا الفيروسي تحددها DENV 3 ‘ رنا UTR يدون القياسية في المختبر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 5: تطبيق مباشر RT-qPCR للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى. مخزون الفيروس المخفف متسلسل يفف (A) و (ب) تشيكف (ج) مليون إلكترون فولط تعرضوا للمقايسة RT qPCR مباشرة باستخدام PCR كبسولة تفجير ويَسْبِر فلوروجينيك محددة لتسلسل الحمض النووي الريبي على كل منهما الفيروسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- والغرض الاسم تسلسل (5 ‘-3’) ملاحظة T7 المروج تنصهر 3 DENV 2 ‘ التضخيم كدنا UTR T7-DENV 3 ‘ إعادة توجيه UTR ﻷعمالهم تاك GAC TCA كبار المستشارين التقنيين العلامة ززجا ج رجا تا السواقين قانون AAA الجميح للسيارات AAA ATG مائل، المروج T7؛ فاصل حروف،؛ جريئة، DENV 2 NGC النيوكليوتيدات 10,270-10,292 رفس DENV 3 ‘ UTR لجنة التنسيق الإدارية أغا TGT TGA عقاري AGC الجميح للسيارات النيوكليوتيدات NGC DENV 2 10,723-10,703 تحليل RT-qPCR DENV UTR و DENV 2 3 ‘ GAC AAG AGG العلامة هفوة نقل واكتساب التكنولوجيا هفوة ج لجنة التنسيق الإدارية المرجع 9 DENV-2 3 ‘ R UTR فريق العمل العالمي السواقين CTG CTG TGC جا تيراغرام TGA التحقيق دن 2-2-4 6FAM–الجميح للسيارات AGC آتا وافق به ACG CTG GGA AAG لجنة التنسيق الإدارية–طمره تحليل RT-qPCR يفف و NS5 يفف كاج جا TGA GGA TCA لجنة التنسيق الإدارية TCT لجنة مكافحة الإرهاب مرجع 14 R NS5 يفف GGA TGT وافق به فريق العمل العالمي CAC AGT AAA TGT ز مسبار NS5 يفف 6FAM–كبار المستشارين التقنيين CGT غيغاطن تج AGC سی كاج الجهاز المركزي للمحاسبات تي-طمره تحليل RT-قبكر تشيكف و E1 تشيك TCG ACG كجك CCT ﻷعمالهم ضريبة تحويل العملة مرجع 15 R E1 تشيك المنسوجات والملابس جا TGC ACC الائتلاف CAC T ف E1 تشيك 6FAM-لجنة التنسيق الإدارية AGC CTG CAC التقييم القطري المشترك عقاري مكافحة الإرهاب أغا ج-طمره تحليل RT qPCR مليون إلكترون فولط و مليون إلكترون فولط N تج CTG القط الجميح للسيارات TCG ع TCA ج مرجع 16 مليون إلكترون فولط N R TGT CCT كاج العلامة تأت الائتلاف وافق به الجهاز المركزي للمحاسبات مليون إلكترون فولط ن ف 6FAM سی AGG ATG السواقين الجهاز المركزي للمحاسبات وافق به TTT CAG A-طمره الجدول 1: التحقيق التمهيدي اليغنوكليوتيد وفلوروجينيك تسلسل المستخدمة في هذه الدراسة. المكونات تركز الأسهم وحدة التخزين (ميكروليتر) التركيز النهائي مواده ماكس بريميستار 2 x 25 س 1 T7-DENV 3 ‘ إعادة توجيه UTR 1 ميكرومتر 10 200 nM رفس DENV 3 ‘ UTR 1 ميكرومتر 10 200 nM اقتصاديون بيرو/DENV 3 ‘ UTR 1 نانوغرام/ميكروليتر 1 20 بيكوغرام/ميكروليتر H2O خالية نوكلاس 4 المجموع 50 الجدول 2: خلط مكونات بكر لإعداد DENV 3 ‘ UTR قالب الحمض النووي. المكونات تركز الأسهم وحدة التخزين (ميكروليتر) التركيز النهائي T7 تنصهر فيها تسلسل DENV 3 ‘ الحمض النووي UTR قالب (متغير) x 100 نانوغرام كل رد فعل الحل ATP 75 مم 2 7.5 مم الحل CTP 75 مم 2 7.5 مم أنشئ الحل 75 مم 2 7.5 مم الحل UTP 75 مم 2 7.5 مم رد فعل المخزن المؤقت 10 x 2 س 1 T7 ميكس إنزيم 2 مثبط رناسي المؤتلف 40 وحدة/ميكروليتر 1 2 وحدات/ميكروليتر H2O خالية نوكلاس 7-x المجموع 20 الجدول 3: مكونات IVT مزيج لتوليف DENV 3 ‘ المعيار UTR الجيش الملكي النيبالي. المكونات تركز الأسهم وحدة التخزين (ميكروليتر) التركيز النهائي في رد فعل RT-قبكر يسبر إيتاق العالمي ميكس رد فعل 2 x 5.00 س 1 إيسكريبت متقدمة المنتسخة العكسية 40 x 0.25 100 نانوغرام كل رد فعل ميكس التمهيدي/التحقيق DENV-2 3 ‘ UTR واو: 3 ميكرومتر 1.00 300 نانومتر DENV-2 3 ‘ UTR R: 3 ميكرومتر 300 نانومتر المسبار 2 دن-2-4:2 ميكرومتر 200 nM H2O خالية نوكلاس 1.75 المجموع الفرعي 8.00 الجدول 4: مكونات مزيج الرئيسي في الوقت الحقيقي RT-قبكر تحليل للحمض النووي الريبي DENV. لاحظ أنه ينبغي إضافة 2 ميكروليتر المجهزة DENV عينة (أو الحمض النووي الريبي القياسية) إلى مزيج الرئيسي 8-ميكروليتر (أي ما مجموعة 10 ميكروليتر كل رد فعل).

Discussion

اليوم، أصبح الكشف عن الحمض النووي الفيروسي PCR الوقت الحقيقي القائم على فلوري بمعيار الذهب للتشخيص الجزيئي للفيروسات البشرية المسببة للمرض، نظراً لحساسية وسرعتها7. هذا مهم خاصة لتأكيد الإصابة بعدوى الفيروس في المرحلة المبكرة من الأمراض المعدية الحادة مثل حمى الضنك17. أيضا، في ميدان البحوث الأساسية دنيف، مقايسة RT-قبكر هو أداة لا غنى عنها لرصد فيروس النسخ المتماثل في المختبر الثقافة، مما سيؤدي إلى فهم بيولوجيا النسخ المتماثل DENV واكتشاف مثبطات المضادة للفيروسات. في هذه الدراسة، المقايسة PCR الوقت الحقيقي القائم على فلوري كان تطويرها بمزيج من معالجة المخزن مؤقت وكاشف RT-PCR خطوة واحدة حيث أن DENV الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة استطاعت كمياً ب RT qPCR دون تنقية جينوم الرنا الفيروسي. عند مقارنتها بفحوصات روتينية للكشف عن الفيروسات النسخ المتماثل، مثل المقايسة اللوحة أو أليسا التقليدية RT-قبكر استخدام الحمض النووي الريبي تنقية6،7، بروتوكول مبسط للمقايسة RT-qPCR أسفرت عن انخفاض كبير في الوقت و الخطوات اللازمة لتحديد كمية الحمض النووي الريبي DENV. وهذا أيضا سمة هامة ومزايا في التقليل من التلوث وفقدان المواد الجينية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام غطاء نظيف ضروري في تركيب IVT (الخطوة 2، 1) وردود الفعل RT-قبكر (خطوات 4.1-4.4) لتجنب التلوث عبر أي من المنتجات ذات الصلة amplicon أو رناسي. كما أنها حاسمة للتعامل مع ثقافة طافية، بما في ذلك الفيروسات المعدية، داخل السلامة الأحيائية مجلس الوزراء (الخطوة 3، 3) للحد من خطر الإصابة بالمختبر.

آخر أهمية الإنزيم RT qPCR المباشر أن طائفة واسعة من نسخ الرنا الفيروسي يمكن أن تحلل في نفس الوقت دون تخفيف أو تركيز العينة. عندما تستخدم تسلسلياً مخفف DENV 3 ‘ رنا UTR معياراً، البروتوكول RT qPCR مباشرة إنتاج منحنى قياسي خطي على مدى سبعة أوامر من حجم، والحد الأدنى للتقدير الكمي 500 نسخة الحمض النووي الريبي (الشكل 2). للكشف عن DENV في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة، 8 × 103 إلى 8 × 10-2 بفو الفيروسات في 10 ميكروليتر RT qPCR كانوا ضمن مجموعة من DENV 3 ‘ المعيار UTR الحمض النووي الريبي، وتم حساب الحد الأدنى للكشف (8 × 10-2 بفو) تحتوي على 11 ، نسخ الحمض النووي الريبي ± 7,077 400 (الشكل 3B). علما، كما ورد في عدة مصفر الدراسات18،،من1920، لوحظ أيضا أن نسبة أكبر من الفيروسية نسخ الحمض النووي الريبي للفيروس عيار المعدية (أي، بفو) في عينات DENV في هذه الدراسة. هذه المبالغة في تقدير يفترض أن تكون إلى حد كبير بسبب وجود خلل (أيغير المعدية) فيروسات أو خالية من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية أطلق سراحهم من الخلايا المصابة والميتة. على الرغم من أن نسبة نسخ الحمض النووي الريبي: بفو التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة (1.1 × 105 إلى 1.3 × 105 الجيش الملكي النيبالي نسخ/بفو) لا يتفق مع البيانات المعروضة سابقا (نسب تتراوح بين 1 إلى 3 سجل)21،20، وهذا قد يكون ويعزى إلى الفارق في سلالات الفيروسات أو الخلايا أو ظروف الثقافة المستخدمة. آخر التفسير المحتمل لهذا التباين، حيث لا توجد عملية تنقية الحمض النووي الريبي متورطة في مقايسة RT-qPCR المباشرة المبينة في هذا التقرير، أكثر من الجيش الملكي النيبالي DENV في المادة طافية الثقافة يمكن الكشف عنها بواسطة تحليل PCR الوقت الحقيقي دون فقدان الفيروسية المواد الجينية.

بساطة RT-qPCR المباشر يعزز القدرة على التعامل مع عدد كبير من العينات في تنسيقات متعددة جيدا، مثل لوحة 96-جيدا. ولذلك، ستساعد هذه الخاصية التطبيق المستقبلي للانزيم قبكر RT مباشرة إلى دراسة فرز الفائق لاكتشاف العقاقير المضادة-DENV. وفي الواقع، في هذا التقرير، تم بحث تطبيق الإنزيم RT qPCR مباشرة للتحقق من مثبط DENV المضادة، الآلام والكروب الذهنية،، والنتيجة أظهرت أنه يمكن مقارنته بقيمة50 IC من الآلام والكروب الذهنية التي حصل عليها المقايسة RT-qPCR المباشرة (الشكل 4) وذكرت في الدراسات السابقة باستخدام اللوحة المقايسة12،13. وهذا يدل على أن قبكر RT مباشرة مقايسة مفيدة لتقييم تأثير المثبطة للعوامل المضادة للفيروسات على نحو مناسب ويمكن اعتمادها في مخدرات فحص الدراسة في المستقبل.

في هذه الدراسة، بذلت محاولات لتطبيق مباشر RT-qPCR للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى. كما هو موضح في الشكل 5، عند تخفيف إذ ثلاثة فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى (يفف، تشيكف، ومليون إلكترون فولط) تصنف إلى أجناس مختلفة (فيروسات مصفرة وتوجافيريداي باراميكسوفيريداي، على التوالي) درست باستخدام سبق الإشعال المبلغ عنها وفلوروجينيك تحقيقات محددة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي الفيروسية منها. تم الحصول على الارتباطات الجيدة بين التتر المعدية وقيم Ct بفحوصات قبكر RT مباشرة، والارتباط أوامر خطية 4-6 من حجم. وهذا يوحي بأن البروتوكول RT qPCR مباشرة قابلة للتكيف لأنواع مختلفة من فيروسات الرنا بمجرد تغيير الإشعال الخاصة بالفيروس ويَسْبِر فلوروجينيك.

ومع ذلك، تتفاوت الحساسية للكشف عن الفيروسات اختبرت في هذه الدراسة (الشكل 5). وينبغي تعديل واحد من البروتوكول التي يمكن تحسين الكشف عن هدف الفيروس الحمض النووي الريبي استخدام مجموعة جديدة من تسلسل التحقيق التمهيدي/. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للمقايسة RT-qPCR المباشر الناجح يعتقد أن الإفراج عن كفاءة الجينوم الفيروسي خلال العينة تجهيز خطوة (الخطوات 3.1-3.4). سيكون هذا من أهمية خاصة للكشف عن فيروسات مستقرة مثل فيروسات غير المغلفة الكمية. على الرغم من أن كتجربة أولية، B3 كوكسساكيفيروس (CVB3)، فيروس الحمض النووي الريبي غير يلفها المنتمين إلى بيكورنافيريداي، تعرضت للمقايسة RT qPCR مباشرة باستخدام كبسولة تفجير CVB3 محددة هو موضح سابقا، ومسبار الفلورية22، تعذر الكشف عن إشارة amplicon إيجابية حتى مع مخزون فيروس عالية-عيار (1 × 105 بفو/mL). ويعتبر هذا يعزى إلى حد كبير إلى السلامة البدنية العالية للفيروسات غير المغلفة. وحتى الآن، بعض فحوصات RT-PCR التي لا تتطلب تنقية الحمض النووي قد وضعت للكشف عن فيروسات الرنا عدة، التي تستخدم بروتوكولات مختلفة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الخطوة23،،من2425، 26. وبالتالي، يزيد استخدام العلاجات البديلة (أو الإضافية)، مثل احتضان عينة الفيروس عند درجة حرارة عالية، يحتمل أن تكون الحساسية للكشف.

وباختصار، كان البروتوكول RT-qPCR المباشر نمواً في هذه الدراسة طريقة بسيطة وسريعة ولكن موثوق بها للتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي الفيروسية في المادة ثقافة طافية من الخلايا المصابة. بسبب هذه البساطة، يمكن عملية المقايسة RT qPCR مباشرة عدد من العينات في وقت قصير، التي تبشر بالتحليل الفائق للنسخ المتماثل الفيروس. وعلاوة على ذلك، تجلى أيضا تطبيق البروتوكول RT qPCR مباشرة إلى غيره من فيروسات الرنا. ولذلك، ينبغي هذا النهج أداة مفيدة لرصد كفاءة في حالات العدوى بالفيروس الحمض النووي الريبي في إعداد بحوث مختبرية، وربما في التشخيص السريري.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون سوبهاش فاسوديفان زاي (اللائي يقبلن ديوك خريج كلية الطب، سنغافورة) لعزل DENV-2 EDEN2 3295 وشونرو إيمورا (محطة الحجر الصحي كوبي، باليابان) يفف د 17 سلالة اللقاح. الكتاب ممتنون أيضا لأعضاء قسم علم الأحياء الدقيقة و “السيطرة على العدوى” لمساعدتها. ويدعم هذا العمل يأمرون كاكينهي المنحة رقم JP16737900.

Materials

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Takara Bio. Inc R045A Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye New England BioLabs B7024S Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder New England BioLabs N3200 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet Astec GST-33 Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9034-70 Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer Eppendorf 6135000905 Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334
TURBO DNase Thermo Fisher Scientific AM2238 Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio. Inc 2313A 40 units/μL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit Takara Bio. Inc 3733Q
Proteinase K Nacalai Tesque 15679-06 > 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad 1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Thermo Fisher Scientific 4346907 Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific StepOnePlus-01 Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
  2. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas–Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  3. Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly?. Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
  4. Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
  5. Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
  6. Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
  7. Tang, K. F., Ooi, E. E. Diagnosis of dengue: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 10 (8), 895-907 (2012).
  8. Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
  9. Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
  10. Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) – study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
  11. Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
  12. Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
  13. Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
  14. Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
  15. Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
  16. Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
  17. Peeling, R. W., et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nature Reviews: Microbiology. 8 (12 Suppl), S30-S38 (2010).
  18. Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  19. Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
  20. Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
  21. Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
  22. Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
  23. Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR–a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
  24. Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
  25. Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
  26. Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).

Tags

Dengue VirusRNA QuantificationReal-time PCRRNA StandardIn Vitro TranscriptionRNA PurificationViral RNA DetectionVirus ResearchDrug ScreeningClinical Diagnosis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Suzuki, Y., Kotoura, M., Yashima, S., Wu, H., Nakano, T., Sano, K. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58407, doi:10.3791/58407 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image