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Immunology and Infection

Medición de ARN del Virus del Dengue en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real

Published: November 01, 2018
doi:
10.3791/58407
, , , , ,
1Department of Microbiology and Infection Control,Osaka Medical College

Summary

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real combinado con transcripción inversa (RT-qPCR) ha sido ampliamente utilizado para medir el nivel de infecciones por virus ARN. Aquí presentamos un ensayo de RT-qPCR directo, que no requiere un paso de purificación de RNA, desarrollado para la cuantificación de varios virus de RNA, incluyendo el virus del dengue.

Abstract

En la actualidad, la tecnología de reacción en cadena (PCR) en tiempo real de la polimerasa es una herramienta indispensable para la detección y cuantificación de genomas virales en los laboratorios de investigación, así como para el diagnóstico molecular, debido a su sensibilidad, especificidad, y comodidad. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el análisis cuantitativo de PCR (qPCR) utiliza generalmente para detectar la infección por el virus se ha basado en la purificación del ácido nucleico viral antes el paso de la polimerización en cadena. En este estudio, el análisis de qPCR (RT-qPCR) transcripción inversa basada en fluorescencia se desarrolla a través de la combinación de un búfer de procesamiento y un reactivo de RT-PCR de un paso para que el proceso entero, desde la cosecha del sobrenadante de cultivo de virus-infectados de la células hasta la detección en tiempo real, puede realizarse sin la purificación del ARN viral. El protocolo establecido permite la cuantificación de una concentraciones de amplia gama de RNA del virus del dengue (DENV) dentro de 90 minutos. Además, la capacidad de adaptación de la prueba de RT-qPCR directa a la evaluación de un agente antiviral es demostrado en un experimento en vitro con un inhibidor DENV previamente divulgado, el ácido micofenólico (MPA). Además, otros virus de RNA, incluyendo el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de Chikungunya (CHIKV) y virus del sarampión (MeV), se pueden cuantificar por RT-qPCR directo con el mismo protocolo. Por lo tanto, el ensayo de RT-qPCR directo descrito en este informe es útil para supervisar la replicación de virus de ARN de una manera rápida y sencilla, que se desarrolle en una prometedora plataforma para un estudio de proyección de alto rendimiento y diagnóstico clínico.

Introduction

El género Flavivirus de la familia Flaviviridae comprende más de 70 envuelto, virus de ARN de cadena positiva que son transmitidos por mosquitos y garrapatas. Lo importante, infección de flavivirus en los seres humanos a menudo conduce a enfermedades clínicas graves, como encefalitis y fiebre hemorrágica1. De hecho, un reciente brote del virus Zika (ZIKV), un flavivirus, se ha extendido explosivamente en las Américas y ha demostrado estar asociada con complicaciones neurológicas, incluyendo microcefalia2,3. Flaviviruses, por lo tanto, tener impacto clínico y económico significativo en sociedad moderna.

Un flavivirus importante es el virus del dengue (DENV), un virus transmitido por mosquitos, ampliamente distribuido en las zonas tropicales y subtropicales del mundo. DENV es transmitida por mosquitos Aedes , incluyendo a Aedes albopictus y Aedes aegypti, lo que resulta en la difusión de brotes de dengue4. Actualmente, la Organización Mundial de la salud (OMS) clasifica la enfermedad del dengue como tres categorías: dengue sin señales de advertencia, dengue con señales de alarma y dengue grave4. Aunque la infección primaria con uno de los cuatro serotipos de DENV (DENV-1 a -4) es a menudo asintomática o autolimitada, estudios epidemiológicos han demostrado que la infección secundaria de los diferentes serotipos aumenta el riesgo de las formas más graves de dengue. Cabe destacar mejora dependiente de los anticuerpos de la infección por DENV causada por la no – o subneutralizing anticuerpos producidos durante la infección primaria ha sido propuesta como un mecanismo potencial de dengue grave que ocurrió como la infección secundaria. Sin embargo, ningún fármaco antiviral específico está disponible para DENV infección5.

Para el desarrollo de los agentes antivirales contra DENV, rutina y análisis robustos, que son susceptibles de un entorno de alto rendimiento, son esenciales para detectar cuantitativamente la replicación del virus. Convencionalmente, ensayos biológicos (p. ej., ensayo de placa) para la cuantificación de virus infecciosos y ensayos inmunológicos (p. ej., análisis enzima-ligado del inmunosorbente [ELISA]) para la detección de antígenos virales se han utilizado para supervisar DENV la replicación in vitro e in vivo6,7. Sin embargo, estos ensayos son a menudo laboriosos y requieren varios días para lograr, que impide el manejo de grandes cantidades de muestras. En este sentido, RT-qPCR es una prueba confiable para detectar la infección por DENV: es específico, sensible y relativamente rápida7. Además, la técnica de RT-qPCR tiene más ventajas en un formato de alto rendimiento. Sin embargo, el procedimiento típico de RT-PCR para virus ARN exige la recuperación de ácidos nucleicos virales de muestras colectadas. Aunque pueden emplearse varios métodos de extracción para RT-qPCR, aún se requieren varios pasos para obtener el ARN viral purificado. Además, ensayos de RT-qPCR generalmente requieren columnas spin caros o peligrosos solventes orgánicos, haciendo más engorroso el proceso de preparación. Ya que evitar el mal uso o la contaminación cruzada entre muestras es un factor crítico para el éxito cuantificación de genomas virales, un método menos laborioso y desperdiciador de tiempo es preferible, especialmente si RT-qPCR es aplicable a formato de alto rendimiento.

Aquí, Divulgamos un simple procedimiento de RT-qPCR para medir las RNA DENV en un sobrenadante de cultivo de las células infectadas que no implica purificación del ARN viral. Este protocolo de RT-qPCR optimizado se compone de dos pasos: i) la incubación de un sobrenadante de cultivos celulares infectados con DENV con un búfer de procesamiento y ii) un paso RT-qPCR en un instrumento PCR en tiempo real. Por consiguiente, DENV ARN en un sobrenadante de cultivo se pueden detectar dentro de 90 minutos (figura 1). También se describe la aplicación de la RT-qPCR directo a otras infecciones de virus de ARN.

Protocol

1. preparación de la plantilla de la DNA del RNA estándar Preparar un PCR mix (volumen total de 50 μL, tabla 1) utilizando el ADN de un plásmido vector que contiene a C de Nueva Guinea de DENV-2 (NGC, número: AF038403.1) 3′ no traducido región (3′ UTR)8 e imprimaciones (T7-DENV 3 ‘UTR Fwd y DENV 3′ UTR Rvs) en un tubo de 0.2 mL, como se describe en la tabla 2.Nota: Este paso debe realizarse bajo una campana de limpiarla (o en una sala limpia) para evitar la contaminación de cualquier producto relacionado con amplicones. Amplificar por PCR el cDNA de T7 fusionados con secuencia DENV 3′ UTR en un termociclador, utilizando las siguientes condiciones: 30 ciclos (de 98 ° C por 10 s, 55 ° C durante 5 s y 72 ° C por 5 s). Mezcla de la reacción de PCR con 10 μL de 6 x tinte gel-carga y carga en una agarosa 1% gel con una escala molecular de ADN que van desde 0.1 hasta 10 pares del kilobase (kbp). Visualizar el producto PCR (479 pares de bases [PB]) bajo luz UV de onda larga mediante un método de visualización de ADN y un gel sistema de imagen. Corte la banda de ADN con un bisturí limpio. Extracto de ADN utilizando un kit de purificación de ADN (Tabla de materiales).Nota: Este paso de purificación puede realizarse fuera de la campana limpia, pero es esencial para mantener un ambiente limpio durante el proceso para evitar la contaminación de la Rnasa, que es un problema importante en los siguientes pasos de DENV ARN síntesis estándar. Pesa el trozo de gel y añadir 100 μL de buffer de captura por 100 mg de gel de slice en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Disolver el gel por la incubación a 60 º C durante 5-15 minutos. Armar una columna de purificación de ADN con un tubo de colección y transferir 600 μL de la muestra disuelta en la columna de purificación. Centrifugar a 16.000 x g durante 30 s y descartar el flujo a través. Si el volumen de muestra es mayor que 600 μL, aplicar el resto de la muestra a la columna de purificación de ADN después de la primera vuelta y repita este paso. Aplicar 500 μL de amortiguamiento a la columna de purificación de ADN se lavan. Centrifugar a 16.000 x g durante 30 s. Coloque la columna en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 50 μL de tampón de elución e incubar la columna a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar a la máxima velocidad durante 1 min eluir el ADN. Medir la densidad óptica del ADN a 260 nm en un espectrofotómetro usando 3 μL de la muestra eluída. Utilizar el mismo volumen de tampón de elución como un espacio en blanco.Nota: La plantilla de la DNA puede almacenarse a-20 ° C hasta su uso. 2. síntesis de la ARN DENV 3′ UTR estándar Nota: Mantenga la ribonucleasa (Rnasa)-ambiente libre tanto como sea posible para llevar a cabo los siguientes pasos. La preparación del reactivo debe realizarse dentro de una campana limpia, con tubos, puntas y pipetas libres de nucleasas. Mezclar la en vitro (IVT) reacción transcripción (de un volumen total de 20 μL) con 100 ng de T7 RNA promotor secuencia fundido DENV 3′ UTR plantilla de la DNA (de paso 1.6) en un tubo PCR de 0,2 mL como se describe en la tabla 3. Incubar la mezcla a 37 ° C en el termociclador durante 2 h. Añadir 1 μL de DNasa a la reacción de IVT y continuar la incubación a 37 ° C durante 15 minutos. Purificar el en vitro transcrito RNA usando un kit de purificación de RNA (Tabla de materiales). Añadir 80 μL de ARNasa-libre H2O y 350 μL de buffer de captura, incluyendo 1% β-mercaptoetanol. Añadir 250 μL de etanol al 100% a la reacción de IVT y mezclar por pipeteo. Armar una columna de purificación de RNA con un tubo de recogida y la muestra de RNA de transferencia a la columna de purificación. Centrifugue a 8.000 x g durante 15 s y descartar el flujo a través. 500 μL de tampón de lavado se aplica a la columna de purificación de RNA y centrifugar a 8.000 x g durante 2 minutos. Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 50 μL de ARNasa-libre H2O e incubar la columna a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar a la máxima velocidad durante 1 min eluir el RNA. Medir la densidad óptica del ARN a 260 nm en un espectrofotómetro, usando 3 μL de la muestra eluída. Utilizar el mismo volumen de H2O como un espacio en blanco. Determinar el número de copia del DENV 3′ UTR ARN sintetizado. 1 ng de DENV 3′ UTR ARN (462 bases, figura 2) es comparable a 4.05 x 109 copias. Estándar de la tienda el ARN a-80 ° C hasta su uso. 3. procesamiento de muestras del Virus por RT-qPCR Nota: Pasos 3.1-3.3 deben realizarse dentro de un gabinete de seguridad biológica. En particular, manejo del sobrenadante de cultivo que contiene un virus infeccioso debe realizarse bajo ambiente bioseguridad nivel 2 (o superior). Mezcla 199 μL de tampón de transformación y 1 μL de libre de nucleasa proteinasa K. Diluir en serie sintetizada DENV 3′ UTR RNA (del paso 2.6) 1:10 para obtener 5 x 109 a copias de 5 x 10 3/μL de ARN de estándar utilizando medio de cultivo (p. ej., DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino y antibióticos [DMEM/10% FBS]) de la célula contiene inhibidor de Rnasa de 40 unidades/mL. Mezcla 5 μL del sobrenadante de cultivo de células infectadas con DENV y DENV 3′ UTR ARN estándar con 5 μL de solución tampón/proteinasa K (desde el paso 3.1) de procesamiento usando tiras de 8 tubos PCR o una placa PCR de 96 pocillos. Como no es de plantilla control (NTC), mezclar 5 μL de medio de cultivo celular (es decir, no hay virus es incluido) con 5 μL de la solución tampón/proteinasa K de procesamiento. Después de una breve centrifugación, incubar las muestras en un termociclador con las siguientes condiciones: 1 ciclo (25 ° C por 10 min y 75 ° C por 5 min).Nota: Muestras procesadas pueden conservarse a 4 ° C si se realiza el análisis PCR en tiempo real el mismo día. Para el almacenamiento a largo plazo, las muestras deben almacenarse a-80 ° C. 4. real-time PCR Análisis Nota: Se recomienda encarecidamente realizar pasos 4.1-4.4 dentro de una campana limpia para minimizar la contaminación de productos relacionados con productos o Rnasa. Preparar una mezcla maestra de RT-qPCR con un reactivo de RT-PCR de un solo paso (Tabla de materiales) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (libre de ARNasas) con DENV 3′ UTR específicos cebadores y una sonda fluorógenos (cuadros 1). Aumentar el volumen de cada componente (tabla 4) según el 11% más del número total de muestras, incluyendo las reacciones de RNA y NTC estándar. Alícuota 8 μL de la mezcla principal en el pozo para ser utilizado en una placa PCR en tiempo real de 96 pozos (Tabla de materiales). Centrifugue las muestras procesadas, incluyendo el DENV 3′ UTR ARN estándar y NTC (del paso 3.4) y añadir 2 μL de las muestras en cada pocillo de la placa PCR en tiempo real de 96 pocillos. Sellar la placa PCR con la película ópticamente transparente adhesiva. Centrifugar brevemente la placa a 200 x g para eliminar las burbujas de aire. Colocar la placa en un instrumento PCR en tiempo real y ciclo de la placa con las siguientes condiciones: 1 ciclo de la RT de la etapa (25 ° C por 10 min), 1 ciclo de la etapa de activación de la polimerasa 95 ° C por 2 min, 40 ciclos de la etapa de amplificación (95 ° C para 10 s y 60 ° C durante 30 s [solo de adquisición de datos en este paso]). Determinar el número de copia del DENV ARN en muestras utilizando un software de asociados de PCR en tiempo real. En la ventana de configuración , asignar el pozo de una reacción que debe ser analizado como muestra desconocida . Asignar el pozo del serie diluido DENV 3’ UTR ARN como estándar y escriba el número esperado copia de norma de RNA en cada pozo (por ejemplo, si se utilizan 5 x 103 copias/μL de solución patrón de RNA, tipo 5.000). Asignar el pozo como Control negativo para NTC. En la ventana de análisis , haga clic en analizar y asegúrese de que el coeficiente de correlación (R2) de la curva estándar generada es equivalente o superior a 0.98. En general, utilice la configuración predeterminada de Ct (umbral: ciclo de inicio automático, línea de base: auto, línea de base final ciclo: auto) para el análisis.Nota: El número de copias de muestras desconocidas se calcula automáticamente en función de los valores umbral de ciclo (Ct) de las reacciones individuales. El número calculado de la copia de cada muestra se considera como reacción de RT-qPCR μL de RNA copias por 10 (por ejemplo, si se indica 12.345 en una muestra desconocida , esto significa que 12.345 copias de RNA de DENV están presentes en la reacción).

Representative Results

Para la cuantificación de ARN de DENV por análisis de RT-qPCR, un estándar del número de copia conocida, que puede ser detectado por la misma cartilla, es un requisito previo. En el presente Protocolo, el 462 RNA nucleótidos de largo que contiene el 3’UTR secuencia de la cepa de DENV-2 NGC fue en vitro transcritos de RNA T7 promotor fusionados con DENV-2 3′ plantilla de la DNA de la UTR, que había sido amplificado por PCR y purificada (figura 2A y 2B). cuando una dilución seriada 10 veces de la norma DENV ARN (de 5 x 10-9 a 5 x 102 copias en una reacción de RT-qPCR de 10 μL) fue sometido a un análisis directo de la RT-qPCR utilizando 3′ cartillas específicas UTR y una fluorógenos sonda de9, una lineal curva con un buen coeficiente de correlación (R2 = 0.98726) fue obtenida (figura 2). A continuación, este ensayo de RT-qPCR directa fue aplicada para cuantificar el DENV en el sobrenadante de cultivo de células infectadas por virus. DENV-2 (Singapur aislante EDEN2 329510), que había sido propagada en células de mosquito C6/36 y titula mediante ensayo de placa utilizando células de BHK-2111, se diluyó en serie (de 8 x 106 a 80 placa formación unidades [PFU] / ml). DENV se luego tratado con un volumen igual de buffer de tratamiento con proteinasa K para deproteinize viriones y sometido a un ensayo de RT-qPCR directo contra el DENV 3′ secuencia de ARN de UTR. Una vez más, una buena correlación (R2 = 0.99981) entre el título DENV infeccioso y el Ct, un número de ciclo que es considerado como el punto donde se levanta la señal fluorescente con crecimiento exponencial sobre el fondo, se obtuvo (Figura 3A). Cuando los valores de Ct generados a partir de una dilución seriada de las existencias DENV con títulos infecciosos conocidos se trazaron en la curva estándar con en vitro transcritos 3′ UTR RNA, todos las parcelas obtenidas de 8 x 106 a 80 PFU/mL (equivalente a 8 x 103 a 8 x 10-2 PFU en una reacción de RT-qPCR de 10 μL) fueron dentro de la gama de los sometidos a RNA estándar (5 x 109 a 5 x 103 copias en una reacción de RT-qPCR de 10 μL, figura 3B), indicando que el DENV muestras con una amplia gama de infecciosas los títulos pueden ser analizados al mismo tiempo, utilizando este directo RT-qPCR. En experimentos paralelos, se investigó el efecto de procesamiento buffer o tratamiento de proteinasa K en la detección de RNA viral por RT-qPCR análisis. Aunque el tratamiento de una dilución de registro de la muestra DENV (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) con salina tamponada con fosfato (PBS) sola antes de RT-qPCR (dilución 1:1 de la muestra de virus con PBS) y una incubación de 25 ° C por 10 min y 75 ° C durante 5 minutos sacada una curva de regresión (figura 3, línea negra) y los valores promedio de Ct obtenidos por el tratamiento de PBS se retrasaron 2,6 – 3,2 ciclos en comparación con la Ct obtenido por procesamiento tratamiento de buffer/proteinasa K (figura 3, línea de puntos). Además, la mayor dilución del virus (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU por reacción de RT-qPCR 10 μL]) no se podía detectar con este tratamiento de PBS (figura 3). En la ausencia de proteinasa K durante el tratamiento del búfer de procesamiento (línea de lafigura 3, gris), se generó una regresión similar; sin embargo, el retraso en la amplificación (ciclos de 0,1 – 0,8) todavía se observó en relación con la reacción del tratamiento con proteinasa K (figura 3, línea de puntos). Estos datos indican que, entre las condiciones de prueba, el tratamiento de la muestra DENV con tampón de procesamiento junto con proteinasa K mejora la sensibilidad de la prueba de RT-qPCR. El ensayo de RT-qPCR directo se evaluó más para su aplicabilidad a validar agentes antivirales contra DENV. Ácido micofenólico (MPA), un inhibidor del nonnucleoside de la inosina monofosfato deshidrogenasa que es utilizado como un inmunosupresor en el trasplante, se ha divulgado para inhibir DENV en vitro12,13. Aunque los estudios anteriores emplearon un ensayo de placa convencional o un análisis de citometría de flujo para detectar antígenos virales para demostrar el efecto inhibitorio de MPA en DENV infección12,13, en el presente estudio, directo RT-qPCR aplicado para evaluar la actividad antiviral de la MPA. Las células HeLa, que habían sido sembradas a una densidad de 5 x 104 células/pocillo de una placa de 24 pocillos 1 día antes de la infección, fueron expuestas a DENV-2 en una MOI de 1 por 1 h y, después del lavado, cultivan con FBS DMEM/10% en presencia de 50 – 0.016 μg/mL () MPA o 0.1% de dimetilsulfóxido [DMSO]). La cultura sobrenadante se recoge 3 días después de la infección y sometida al directo análisis de RT-qPCR utilizando iniciadores específicos de DENV 3′ UTR y una sonda fluorescente. La figura 4 muestra las copias de RNA de DENV (por reacción) en los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas tratadas con el aumento de las concentraciones de amp, que fueron determinadas por una en vitro transcrita norma ARN UTR 3′. Con un tratamiento de 50 μg/mL (156 μM) MPA, se observó una reducción a 99.87 ± 0.02% de la cultura de control tratados con DMSO (figura 4). Importante, el valor de IC50 (concentración inhibitoria del 50%) de MPA, determinado por los datos mostrados en la figura 4 fue 0,79 μM, que es similar a los valores anteriormente registrados12,13. Este resultado, por lo tanto, indica que este ensayo de RT-qPCR directa es un método útil y confiable para evaluar el efecto inhibitorio de los antivirales en la infección por DENV. Finalmente, se analizaron aplicaciones de la prueba de RT-qPCR directa a otros virus de RNA. Cuando un stock de fiebre amarilla (YFV) D 17 vacuna contra la cepa del virus (Flaviviridae), que había sido ampliada en células Vero y graduado en células BHK-21, fue sometido a RT-qPCR utilizando cartillas YFV-D 17-específicas y un fluorógenos sonda14, como se describe en la tabla 1, podría generar una curva estándar con buena correlación directa entre los valores de Ct y títulos con una dilución seriada 10 veces de la acción de virus (3.2 x 105 a 3,2 PFU/mL, figura 5A). Asimismo, dirigir análisis RT-qPCR de virus de Chikungunya (CHIKV, Togaviridae) stock de cepa de Ross, que había sido ampliada en células Vero y graduado en células BHK-21, utilizando cebadores específicos de CHIKV y fluorógenos sonda15 (tabla 1), dio una buena regresión entre títulos infecciosas (4.4 x 108 a 4.4 x 103 PFU/mL) y los valores de Ct (figura 5B). Este fue también el caso para la detección de una dilución seriada (8 x 10-2 8 x 10-2 PFU/mL, figura 5) del virus del sarampión (MeV, Paramyxoviridae) que se habían propagado y tituló con células Vero, utilizando previamente iniciadores reportados y fluorógenos sonda16 (tabla 1). Estos datos demuestran la adaptabilidad de la directa análisis de RT-qPCR para la detección cuantitativa de diversos virus de ARN. Figura 1: flujo de trabajo de la prueba de RT-qPCR directa. El sobrenadante de cultivo de células infectadas con DENV es tratado con un tampón de procesamiento que contiene proteinasa K para liberar el ARN viral (paso de proceso de la muestra). La muestra procesada luego es mezclada con un reactivo de RT-PCR de un solo paso y sometida para el análisis PCR en tiempo real utilizando primers 3′ UTR específicos DENV y una sonda fluorógenos. Los niveles de RNA viral detectados en las muestras respectivas pueden ser determinados por un estándar en serie diluido usando en vitro transcrito RNA DENV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: una curva estándar generada por DENV 3′ UTR RNA. (A) estándar ARN que contiene 3′ UTR de DENV-2 NGC fue transcrito en vitro de un fragmento PCR fusionados con la secuencia promotor de T7 ARN. (B) purificada DENV 3′ UTR RNA (250 ng) se visualizó en un gel de agarosa al 1% (carril derecho). El carril de la izquierda muestra el marcador de peso molecular para electroforesis de RNA. (C) A dilución log del DENV 3 ‘UTR ARN estándar fue tratada con el tampón de tratamiento con proteinasa K y sometido a un análisis PCR en tiempo real utilizando un reactivo de un solo paso RT-qPCR y DENV 3′ UTR-cartillas específicas de la y un set de sonda fluorógenos. Los valores promedio de Ct (n = 3) obtenidas en las diluciones respectivas se trazaron contra la cantidad estimada de 3′ UTR de ARN (5 x 109 5 x 102 ARN copias en una reacción de RT-qPCR de 10 μL). R2 es el coeficiente de correlación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: la cuantificación de ARN de DENV en la acción del virus por RT-qPCR directo. (A) del alto-título DENV-2 stock producido en células C6/36 en serie fue diluida 10 veces (8 x 106 a 8 x 101 PFU/mL) con equipos de DMEM/10% que contiene un inhibidor de la Rnasa y sometidos al ensayo de RT-qPCR directo utilizando primers 3′ UTR específicos DENV /Probe. (B) Ct obtenidas por RT-qPCR de stock DENV registro diluido (círculos) se trazaron en una curva estándar de 3′ UTR ARN (triángulos) transcribe in vitro. El uso de 8 x 106 stock PFU/mL en un ensayo de RT-qPCR directo corresponde a 8 x 103 PFU del virus en 10 μL de la reacción de RT-qPCR. (C) este panel muestra el efecto buffer y tratamientos proteinasa K en la detección de RNA viral. Stock DENV diluido (8 x 106 a 8 x 102 PFU/mL) se incubaron con un volumen igual de buffer de tratamiento con proteinasa K (círculos blancos), procesamiento de buffer solo (círculos grises) o PBS (círculos negros) y luego sometido a la directa Ensayo de RT-qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: evaluación del efecto inhibitorio de la MPA por RT-qPCR directo. Las células HeLa fueron infectadas con DENV-2 en un MOI 1 y cultivadas en presencia de aumento de las concentraciones de amp, un inhibidor previamente divulgado de DENV (o 0.1% DMSO). Tres días después de la infección, sobrenadantes de cultivo de las células infectadas fueron recogidos y sometidos al ensayo de RT-qPCR directo con DENV 3′ UTR específicos primers/sonda. El número de copias de ARN viral fue determinado por DENV 3′ UTR ARN transcrito estándar in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: la aplicación de la directa RT-qPCR para la detección de otros virus ARN. Las poblaciones de virus diluido en serie de (A) YFV CHIKV (B) y (C) MeV fueron sometidas para el ensayo de RT-qPCR directo usando las cartillas PCR y fluorógenos sondas específicas de sus respectivas secuencias de ARN virales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Propósito Nombre Secuencia (5′ – 3’) Nota Promotor de T7-3 DENV-2 fundido ‘ amplificación de cDNA UTR T7-DENV 3′ UTR Fwd TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGgaa c tTA GAA GGC AAA ley AAC ATG AAA Cursiva, promotor de T7; minúscula, espaciador; negrita, NGC DENV-2 nucleótidos 10.270-10.292 DENV 3′ UTR Rvs AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGC Nucleótidos de NGC de DENV-2 10.723-10.703 Análisis de RT-qPCR de DENV DENV-2 3′ UTR F AAG GAC ETIQUETA AGG TTA GAG GAG ACC C Referencia 9 DENV-2 3′ UTR R GGC GTT CTG TGC CTG GAA TG TG Sonda 2 Den-2-4 6FAM-AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-TAMRA Análisis de RT-qPCR de YFV YFV NS5 F TCT DE LA CTC GAA CAG TGA TCA GGA ACC Referencia 14 YFV NS5 R GGA GTT DE TTG TGT CAC AAA AGT TGT G YFV NS5 sonda 6FAM-CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-TAMRA Análisis de RT-qPCR de CHIKV CHIK E1 F TCG ACG CGC CCT CTT TAA Referencia 15 CHIK E1 R ATC GAA TGC ACC GCA CAC T CHIK E1 P 6FAM-CAC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-TAMRA Análisis de RT-qPCR de MeV MeV N F TGG CTG GATO AAC TCG GTA TCA C Referencia 16 MeV N R TGT CCT CAG TAG TAT GCA TTG CAA MeV N P 6FAM-CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-TAMRA Tabla 1: Primer de oligonucleótidos y fluorógenos sonda secuencias utilizadas en este estudio. Componentes Concentración stock Volumen (μL) Concentración final Premezcla de PrimeSTAR Max 2 x 25 1 x T7-DENV 3′ UTR Fwd 1 ΜM 10 200 nM DENV 3′ UTR Rvs 1 ΜM 10 200 nM pEU/DENV 3′ UTR 1 ng/μL 1 20 pg/μL H2O libre de nucleasas 4 Total 50 Tabla 2: Componentes de una polimerización en cadena de la mezcla para la preparación de DENV 3′ UTR plantilla ADN. Componentes Concentración stock Volumen (μL) Concentración final T7 fusionados con secuencia DENV 3′ UTR plantilla de la DNA (variable) x 100 ng por reacción Solución de ATP 75 mM 2 7.5 mM Solución CTP 75 mM 2 7.5 mM Solución GTP 75 mM 2 7.5 mM Solución UTP 75 mM 2 7.5 mM Tampón de reacción 10 x 2 1 x T7 Mezcla de enzima 2 Inhibidor de Rnasa recombinante 40 unidades/μL 1 2 unidades/μL H2O libre de nucleasas 7 – x Total 20 Tabla 3: Componentes de un IVT mezclan para sintetizar el estándar DENV 3′ UTR ARN. Componentes Concentración stock Volumen (μL) Concentración final en reacción de RT-qPCR iTaq universal puntas de mezcla de reacción 2 x 5.00 1 x iScript avanzada de la transcriptasa reversa 40 x 0.25 100 ng por reacción Mezcla de primer punta de prueba DENV-2 3′ UTR F: 3 ΜM 1.00 300 nM DENV-2 3’ UTR R: 3 ΜM 300 nM Sonda 2 Den-2-4: 2 μM 200 nM H2O libre de nucleasas 1.75 Subtotal de 8,00 Tabla 4: componentes de una mezcla maestra para análisis en tiempo real RT-qPCR de ARN DENV. Tenga en cuenta que 2 μL de la muestra procesada DENV (o RNA estándar) se debe agregar a la mezcla principal de 8 μL (un total de 10 μL por reacción).

Discussion

Hoy en día, detección de ácido nucleico viral por PCR en tiempo real basado en fluorescentes se está convirtiendo en un estándar de oro para el diagnóstico molecular de virus humanos patógenos, debido a su sensibilidad y rapidez7. Esto es particularmente importante para confirmar la infección por el virus en la fase temprana de las enfermedades infecciosas agudas tales como la fiebre del dengue17. También, en el campo de la investigación básica de DNEV, RT-qPCR ensayo es una herramienta indispensable para supervisar la replicación del virus en cultivo en vitro , que conducirá a una comprensión de la biología de la replicación de DENV y el descubrimiento de antivirales inhibidores de la. En este estudio, el ensayo PCR en tiempo real basado en fluorescente fue desarrollado por una combinación de un búfer de procesamiento y un reactivo de RT-PCR de un paso para que DENV ARN en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas pudo ser cuantificada por RT-qPCR sin purificación el genoma viral del RNA. En comparación con ensayos de rutina para detectar la replicación del virus, como el ensayo de placa, ELISA o convencional RT-qPCR utilizando RNA purificación6,7, un protocolo simplificado de la prueba de RT-qPCR dio lugar a una gran reducción del tiempo y pasos necesarios para cuantificar el RNA DENV. Esto es también una característica importante que tiene ventajas en reducir al mínimo la contaminación y pérdida de material genético. No obstante, debe señalarse que el uso de una campana de limpieza es esencial en la configuración de la IVT (paso 2.1) y las reacciones de RT-qPCR (pasos 4.1-4.4) para evitar la contaminación cruzada de productos relacionados con productos o Rnasa. También es crucial manejar la cultura sobrenadante, incluyendo virus infeccioso, dentro de un gabinete de bioseguridad (paso 3.3) para reducir el riesgo de infección de laboratorio.

Otra significación de la prueba de RT-qPCR directa es que una amplia gama de copias de RNA virales puede ser analizada al mismo tiempo sin dilución o concentración de la muestra. Cuando se utilizó un serie diluido DENV 3′ UTR ARN estándar, el protocolo de RT-qPCR directo produce una curva estándar lineal sobre siete órdenes de magnitud, y el límite inferior de cuantificación fue de 500 copias de RNA (figura 2). Para la detección de DENV en el sobrenadante de cultivo de las células infectadas, 8 x 103 a 8 x 10-2 virus PFU en 10 μL RT-qPCR estaban dentro de la norma de rango de DENV 3′ UTR ARN, y el límite inferior de detección (8 x 10-2 PFU) se calculó para contener 11 , 400 ± 7.077 copias de RNA (figura 3B). De nota, como se informó en varios flavivirus estudios18,19,20, la proporción más grande de copias de RNA virales a título infeccioso del virus (es decir, PFU) en muestras DENV también fue observada en este estudio. Esta sobrevaluación se supone que es en gran parte debido a la presencia de defectos (es decir, no infecciosa) virus o RNA viral libre liberado de las células infectadas y muertas. Aunque la proporción de copias de RNA: PFU obtenidos en este estudio (1.1 x 105 a 1.3 x 105 RNA copias/PFU) era incompatible con los datos mostrados anteriormente (rango de proporciones de 1 a 3 log)21,20, esto puede ser atribuye a la diferencia en las cepas de virus, células o condiciones de cultivo empleadas. Otra probable explicación para la discrepancia es que, puesto que ningún proceso de purificación de RNA estaba implicado en el ensayo de RT-qPCR directo descrito, más ARN de DENV en el sobrenadante de cultivo podría ser detectado por análisis PCR en tiempo real sin la pérdida de viral materiales genéticos.

La simplicidad de la RT-qPCR directa mejora la capacidad para manejar un gran número de muestras en formatos múltiples bien, tal como una placa de 96 pocillos. Por lo tanto, esta propiedad ayudará a la futura aplicación de la prueba de RT-qPCR directa a un estudio de proyección de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos anti-DENV. De hecho, en este informe, se examinó la aplicación de la prueba de RT-qPCR directa para la validación de un inhibidor anti-DENV, MPA, y el resultado mostró que un valor de IC50 de MPA obtenido por el análisis de RT-qPCR directo (figura 4) fue comparable a la reportado en estudios previos utilizando placa ensayo12,13. Esto demuestra que RT-qPCR directa es una prueba útil para evaluar adecuadamente el efecto inhibitorio de los antivirales y puede ser adoptado en un estudio de detección en el futuro de drogas.

En este estudio, se intentó aplicar el directo RT-qPCR para la detección de otros virus ARN. Como se muestra en la figura 5, cuando las diluciones 10 veces de los otros tres virus RNA (YFV CHIKV y MeV) se clasifican en diferentes géneros (Flaviviridae, Togaviridaey Paramyxoviridae, respectivamente) fueron examinadas usando previamente reportados cartillas y fluorógenos sondas específicas de las respectivas secuencias de ARN virales. Buenas correlaciones entre los valores de Ct e infecciosos títulos fueron obtenidas por análisis de RT-qPCR directos, y las correlaciones eran órdenes de magnitud lineales de 4-6. Esto sugiere que el protocolo de RT-qPCR directo es adaptable a varios tipos de virus del RNA con sólo cambiar los cebadores específicos de virus y fluorógenos sondas.

Sin embargo, la sensibilidad de detección varió entre los virus probados en este estudio (figura 5). Una modificación del protocolo que puede mejorar la detección del ARN del virus de destino debe utilizar un nuevo conjunto de secuencias de primer punta de prueba. Además, un paso clave para el exitoso ensayo de RT-qPCR directo es probablemente la versión eficiente del genoma viral durante la muestra, procesamiento paso (pasos 3.1 – 3.4). Esto sería de particular importancia para la detección cuantitativa del virus estables como un virus no-envueltos. Aunque como un experimento preliminar, Coxsackievirus B3 (CVB3), un virus de ARN no envuelto perteneciente a Picornaviridae, fue sometido al directo ensayo de RT-qPCR utilizando cartillas de CVB3-específicas previamente descritos y sonda fluorescente22, un no se pudo detectar señal positiva amplicon incluso con un stock de virus de alto título (1 x 105 PFU/mL). Esto se considera en gran parte atribuido a la alta integridad física de los virus no-envueltos. Hasta ahora, algunos ensayos de RT-PCR que no requieren de la purificación de ácidos nucleicos han sido desarrollados para detectar varios virus ARN, que emplean distintos protocolos en el lanzamiento de RNA paso23,24,25, 26. así, el uso de los tratamientos alternativos (o adicionales), como una incubación de una muestra de virus a alta temperatura, potencialmente aumenta la sensibilidad de detección.

En Resumen, el protocolo de RT-qPCR directo desarrollado en este estudio fue un método simple y rápido pero fiable para cuantificar el ARN viral en un sobrenadante de cultivo de las células infectadas. Debido a esta simplicidad, el análisis de RT-qPCR directo puede procesar un número de muestras en poco tiempo, que es prometedor para el análisis de alto rendimiento de replicación del virus. Además, también se demostró la aplicación del Protocolo de RT-qPCR directa a otros virus de RNA. Este enfoque debe, por lo tanto, una herramienta útil para monitorear eficientemente las infecciones de virus de ARN en un entorno de laboratorio de investigación y, posiblemente, en diagnósticos clínicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapur) para el DENV-2 aislar EDEN2 3295 y Shunro Imura (estación de cuarentena de Kobe, Japón) para la YFV cepa de la vacuna 17D. Los autores también están agradecidos a los miembros del Departamento de Microbiología y Control de la infección por su ayuda. Este trabajo es apoyado por MEXT KAKENHI concesión número JP16737900.

Materials

PrimeSTAR Max DNA Polymerase Takara Bio. Inc R045A Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye New England BioLabs B7024S Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder New England BioLabs N3200 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet Astec GST-33 Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9034-70 Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer Eppendorf 6135000905 Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334
TURBO DNase Thermo Fisher Scientific AM2238 Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio. Inc 2313A 40 units/μL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit Takara Bio. Inc 3733Q
Proteinase K Nacalai Tesque 15679-06 > 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit Bio-Rad 1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL Thermo Fisher Scientific 4346907 Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific StepOnePlus-01 Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
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Suzuki, Y., Kotoura, M., Yashima, S., Wu, H., Nakano, T., Sano, K. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58407, doi:10.3791/58407 (2018).
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