En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales
Summary
Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.
Abstract
Proyección de imagen de dos fotones es una poderosa herramienta para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro mamífero. Sin embargo, un número limitado de en vivo de imágenes métodos existe para examinar el tejido cerebral de los mamíferos recién nacidos vivos. Aquí se resume un protocolo de neuronas corticales individuales en vida ratones neonatales de la proyección de imagen. Este protocolo incluye las siguientes dos metodologías: (1) el sistema de Supernova para rala y brillante etiqueta de neuronas corticales en el cerebro en desarrollo y (2) un procedimiento quirúrgico para el frágil cráneo neonatal. Este protocolo permite la observación de cambios temporales de neurites corticales individuales durante las etapas neonatales con un alto cociente signal-to-noise. Silenciamiento del gen de célula-específica marcada y octavos de final también se logra combinando la Supernova con RNA de interferencia y gene CRISPR/Cas9 sistemas de edición. Este protocolo puede, por lo tanto, utilizarse para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.
Introduction
El cableado exacto de los circuitos neuronales en la corteza cerebral es esencial para funciones más altas del cerebro como percepción, cognición y aprendizaje y la memoria. Circuitos corticales se refinan dinámicamente durante el desarrollo postnatal. Estudios han investigado el proceso de usar el circuito cortical formación histológica y en vitro el análisis de la cultura. Sin embargo, la dinámica de formación de circuito en los mamíferos de vida ha permanecido en su mayoría inexplorada.
Microscopía de dos fotones ha sido ampliamente utilizado para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro de ratón adulto1,2. Sin embargo, debido a problemas técnicos, sólo un número limitado de estudios ha abordado la formación de circuitos neuronales en ratones recién nacidos. Por ejemplo, Carrillo et al realizar la proyección de imagen de Time-lapse de escalada las fibras en el cerebelo en la segunda semana postnatal3. Portera-Cailliau et al informó la proyección de imagen de los axones corticales capa 1 en la primera semana postnatal4. En el presente estudio, se resume un protocolo para la observación de la capa 4 cortical neuronas y sus dendritas en ratones recién nacidos. Resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo, que incluye dos metodologías, se expresan en nuestra reciente publicación5. En primer lugar, utilizamos la Supernova vector sistema5,6 para el etiquetado de neuronas individuales del cerebro neonatal. En el sistema de la Supernova, las proteínas fluorescentes utilizadas para etiquetar neuronal son caída intercambiable y etiquetada gene célula-específico y análisis de la edición de octavos de final también son posibles. En segundo lugar, se describe un procedimiento quirúrgico para la preparación de ventana craneal en ratones neonatales frágil. Juntos, estas metodologías permiten la observación en vivo de neuronas individuales en el cerebro neonatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo y resolución de problemas:
El paso más crítico del protocolo es la extirpación del cráneo (paso 3.2 del Protocolo). Sobre inserción, la hoja de afeitar a menudo se adhiere a la duramadre, provocando hemorragia dural y daño en el cerebro. Esto puede evitarse añadiendo una gota de tampón de corteza en el cráneo y el cráneo en tampón de corteza.
Sangrado de la duramadre y la piel después de preparación de ventana craneal condu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen su asistencia técnica T. Sato, M. Kanbayashi y S. Kouyama. Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI Grant números JP15K14322 y JP16H06143, la Fundación de ciencia de Takeda, la Fundación conmemorativa de Uehara y el proyecto de investigación colaborativa de Niigata University cerebro investigación Instituto 2017-2923 (H.M.) y por KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 y JP15H04263 y Grant en la investigación científica en áreas de innovación “Regulación dinámica de la función cerebral por chatarra y sistema de construcción” (JP16H06459) de MEXT (T.I.).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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