生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング
Summary
体内の 2 光子イメージング新生児マウスの大脳皮質をイメージングするためのプロトコルを提案します。このメソッドは、皮質ニューロン、神経ダイナミクスと疾患モデルのダイナミクスの変化を制御する分子メカニズムの発達のダイナミクスの分析に適しています。
Abstract
2 光子イメージングは、哺乳類の脳の神経回路網の生体内解析のための強力なツールです。ただし、ライブの新生児の哺乳類の脳組織を調べるため生体内イメージング方法の限られた数が存在します。ここ生きている新生児マウスで個々 の皮質ニューロンをイメージングするためのプロトコルをまとめたものです。このプロトコルには、次の 2 つの方法が含まれています: (1) 疎と明るい脳の発達と (2) 壊れやすい新生児頭蓋手術で大脳皮質ニューロンの分類のための超新星システム。このプロトコルは、高い信号対雑音比と新生児の段階で個々 の皮質神経突起の経年変化の観察をできます。ラベル付きセル固有遺伝子サイレンシングとノックアウトは、RNA 干渉と編集システム CRISPR/Cas9 遺伝子と超新星を組み合わせることで実現できます。皮質ニューロン、神経ダイナミクスと疾患モデルのダイナミクスの変化を制御する分子メカニズムの発達のダイナミクスを分析するため、このプロトコルを使用したがって、ことができます。
Introduction
大脳皮質の神経回路網の正確な配線は、知覚、認知、学習、記憶など、脳の高次機能に不可欠です。生後発達期大脳皮質回路が動的に洗練されました。研究は、組織による皮質回路形成のプロセスと文化の in vitro解析を検討しました。しかし、生きている哺乳類の回路形成のダイナミクスが未踏主が残った。
2 光子顕微鏡は、成体マウス脳1,2の神経回路網の体内の分析に広く使用されています。ただし、技術的な課題により研究の限られた数だけは新生仔マウスにおける神経回路形成を対処しています。たとえば、carrillo さんらは、登上線維第 2 生後週3で小脳のタイムラプス イメージングを実行されます。・ ポルテラ Cailliauらは、最初の生後週4の皮質層 1 の軸索のイメージングを報告しました。本研究では大脳皮質ニューロンの層 4 と新生マウスの樹状突起の観察のためのプロトコルをまとめたものです。2 つの方法が含まれています、このプロトコルを適用した結果は、私たちの最近の文書5で報告されます。まず、新生児の脳の個々 のニューロンを分類のため超新星ベクトル システム5,6を使用します。超新星における神経ラベルに使われる蛍光タンパク質が交換とラベル付きセル固有遺伝子ノックダウンと編集/ノックアウト解析も可能です。第二に、我々 は壊れやすい新生児マウス頭蓋ウィンドウ準備のため手術をについて説明します。一緒に、これらの方法論は、新生児脳で個々 のニューロンの生体内観察を許可します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルで重要な手順とトラブルシューティングします。
プロトコルの最も重要なステップは、頭蓋骨 (プロトコル手順 3.2) の除去です。挿入、時にかみそりの刃は、しばしば硬膜、硬膜出血と脳に損傷を引き起こすに準拠します。これは、頭蓋骨に皮質バッファーのドロップを追加および皮質バッファーで頭蓋骨を削除して回避できます。
頭蓋ウ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、佐藤、昌上林や s. 神山をその技術支援ありがちましょう。この作品は日本学術振興会科研費助成番号 JP15K14322 と JP16H06143、武田科学財団、上原記念財団の共同研究プロジェクトの新潟大学脳研究所 2017年-2923 (陛下) とサポートされています。科研費 JP16K14559、JP15H01454 と JP15H04263、イノベーション分野「スクラップ & ビルド システムによる脳機能の動的制御」研究助成金で (JP16H06459) (ti) は、文部科学省から。
Materials
| pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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