אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal
Summary
נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
Abstract
שני הפוטונים הדמיה הוא כלי רב עוצמה לניתוח ויוו של מעגלים עצביים במוח של יונקים. עם זאת, מספר מוגבל של ויוו בשיטות הדמיה קיימים לבחינת על רקמת המוח של יונקים היילוד בשידור חי. בזאת אנו מסכמים את פרוטוקול הדמיה נוירונים בודדים בקליפת המוח בעכברים neonatal חי. פרוטוקול זה כולל את מתודולוגיות שני הבאים: (1) מערכת סופרנובה דלילים ובהירים תיוג של נוירונים בקליפת המוח המוח המתפתח, (2) הליך כירורגי על הגולגולת neonatal שביר. פרוטוקול זה מאפשר התבוננות שינויים הטמפורלי של הפרט neurites קורטיקלית בשלבים neonatal עם יחס אות לרעש גבוה. גם ניתן להשיג על ידי שילוב של הסופרנובה עם הפרעה RNA ו CRISPR/Cas9 ג’ין עריכה מערכות שכותרתו תא ספציפי ג’ין להחרשת, נוק אאוט. פרוטוקול זה, לכן, ניתן להשתמש לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים השולטים על דינמיקה עצביים, וכן שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
Introduction
החיווט מדויק של מעגלים עצביים בקליפת חיוני עבור תפקודי המוח כולל תפיסה, קוגניציה, למידה וזיכרון. מעגלים בקליפת המוח הם מעודן באופן דינמי במהלך הפיתוח כמחנכת. מחקרים חקרו את תהליך השימוש היווצרות מעגל קורטיקלית היסטולוגית וניתוחים in vitro לקשרי תרבות. עם זאת, הדינמיקה של היווצרות מעגל ביונקים החיים נשאר בעיקר נחקרו.
מיקרוסקופ שני הפוטונים כבר בשימוש נרחב עבור הניתוחים ויוו של מעגלים עצביים העכבר למבוגרים המוח1,2. עם זאת, בשל האתגרים הטכניים, רק מספר מצומצם של מחקרים עסקו מעגלים עצביים היווצרות בעכברים היילוד. לדוגמה, קאריו. ואח לביצוע ההדמיה בצילום מואץ של טיפוס סיבי המוח הקטן של שבוע לאחר הלידה השניה3. . Portera-Cailliau et al. דיווח על ההדמיה של אקסונים בשכבת קורטיקלית 1 שבוע לאחר הלידה הראשונה4. במחקר הנוכחי, אנו מסכמים את פרוטוקול להשגחה של נוירונים בקליפת המוח של שכבה 4, שלהם דנדריטים בעכברים היילוד. התוצאות המתקבלות על-ידי החלת פרוטוקול זה, הכולל שתי מתודולוגיות, מדווחים הפרסום האחרונה שלנו5. ראשית, אנו משתמשים5,6 מערכת וקטור סופרנובה עבור תיוג נוירונים בודדים במוח neonatal. במערכת סופרנובה, החלבונים פלורסנט משמש תיוג עצביים גנים ספציפיים תא להחלפה ומתויגים הינם ניתוחים עריכה/נוק-אאוט הינם אפשריים. שנית, אנו מתארים הליך כירורגי להכנה חלון הגולגולת בעכברים neonatal שביר. יחד, מתודולוגיות אלה מאפשרים התצפית ויוו של נוירונים בודדים במוח neonatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול לפתרון בעיות:
השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הינו של הגולגולת (פרוטוקול שלב 3.2). בשעת ההוספה, גילוח לאנאפוליס לעיתים קרובות השכבה הקשה של המוח, גורם לדימום. קרום נזק למוח. זה ניתן למנוע על-ידי הוספת טיפה של קליפת מאגר על הגולגולת והסרה הגולגולת במאגר בקל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה סאטו ט, מ Kanbayashi ו- Kouyama ס’ לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על- ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP15K14322, JP16H06143, קרן המדע טקדה, קרן ההנצחה Uehara ו את שיתופי מחקר פרויקט של נייגאטה אוניברסיטת המוח מחקר מכון 2017-2923 (H.M.) KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, ו JP15H04263, במענק מחקר מדעי בתחומים חדשנות “דינמי ויסות תפקוד המוח על ידי גרוטאות & לבנות מערכת” (JP16H06459) מ- MEXT (רכב מורשה).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
