JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Иммуногистохимическое определение 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин в развивающихся и Постмитотические мыши сетчатки

Published: August 29, 2018
doi:
10.3791/58274
, , ,
1BioTime, Inc

Summary

Цель настоящего доклада заключается в том, чтобы описать протокол для надежной Иммуногистохимическое определение эпигенетические маркеры, 5-метилцитозин (5мс) и 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC) в разработке и Постмитотические мышь сетчатки.

Abstract

Эпигенетики сетчатки развития является полем хорошо изученных исследования, который обещает принести новый уровень понимания механизмов различных человека дегенеративных заболеваний сетчатки и определить новые подходы к лечению. Ядерные архитектура мыши сетчатки организована в двух различных моделей: обычные и инвертированных. Обычные шаблон универсального где гетерохроматин локализован на периферии ядра, в то время как активные euchromatin проживает в ядерной интерьер. В отличие от этого Перевернутый ядерного модель уникальна для взрослых стержень фоторецепторных клеточных ядер гетерохроматин локализуется на ядерный центр, где euchromatin проживает в ядерной периферии. Метилирование ДНК наблюдается преимущественно в chromocenters. Метилирование ДНК является динамический ковалентная модификация на остатки цитозином (5-метилцитозин, 5МС) dinucleotides CpG, которые обогащаются в регионах промоутер многих генов. Три methyltransferases ДНК (DNMT1, DNMT3A и DNMT3B) участвуют в метилирования ДНК в процессе разработки. Детектирования 5мс с иммуногистохимических методов является очень сложным, способствуя изменчивости в результатах, как все оснований ДНК, включая 5мс изменение базы скрыты внутри спирали двуцепочечной ДНК. Однако подробные делимитация 5мс распределения во время разработки является весьма информативным. Здесь мы описываем воспроизводимый техника для обнаружения надежные иммуногистохимических 5мс и другой эпигеномные ДНК маркер 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), который colocalizes с «открытой», транскрипционно активных хроматина в развивающихся и Постмитотические мыши сетчатки.

Introduction

Эпигеномные регулирование развития и Постмитотические гомеостаза мыши сетчатки является захватывающей области исследований, который обещает принести Роман понимание биологических механизмов, контролирующих определение судьба retinogenesis и клетки, клетки определенного типа метаболические функции, а также патологий клеток, гибель клеток и регенерации1,2,3,4,5,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. chromatin претерпевает динамичные изменения в области развития, а также в ответ на переменных внешних сигналов ли это стресс, метаболические или ячейки смерти раздражители6,14,15, 16 , 17 , 18. в ядрах мыши, хроматина делится на euchromatin активных и неактивных гетерохроматин6,19,20. В интерфазе ядра euchromatin проживает в регионе внутреннее ядро то гетерохроматин линии ядерной периферии и ядрышко. Этот шаблон называется обычных и высоко сохраняется у эукариот. В отличие от стержня ядер в ночных животных, таких как мыши и крысы Перевернутый шаблон, где ядро занята гетерохроматин в центре, в окружении формирования внешней оболочки6,18, euchromatin 20. При рождении род ядер имеют обычных ядерных архитектуру. Инверсии стержня ядер происходит во время разработки путем реконструкции обычных ядерной архитектуры. В ходе этого процесса периферических гетерохроматин отделяет от ядерной периферии и chromocenters сливаются в форме единого chromocenter в центре ядра6,18.

Геномная метилирование ДНК участвует в управление местных хроматина конформации21. Метилирование ДНК происходит в 5′ положении цитозина остатков dinucleotides CpG, которые обогащаются в регионе промоутер многих генов в мыши геномов22,23,24,25,26 а также в intergenic и регионах Интрон, которые несут регуляторных элементов27. Важную роль в регулировании динамическое состояние двухвалентные хроматина, содержащий множество метилирования CpG островов в проксимальном промоутеров21,24 и CpG последовательности гена усилители27,28 развития генов/транскрипционных факторов играет важную роль в развитии, рак и старения29,30,,3132,33,34 . В метилирования дна во время мыши развития35участвуют три ДНК methyltransferases (DNMTs). Все три DNMTs выражаются в ходе мыши сетчатки развития36 и сетчатки специфичных изменений в Dnmt генов воздействия сетчатки развития2,7. Гидроксиметилцитозин (5hmC) является оксидативный продукт деметилирования 5-метилцитозин (5мс). Три десять-одиннадцать транслокация (тет) ферменты участвуют в 5мс деметилирования37,,3839. Модификация гидроксиметил-C обогащается промоутеров, Джин органов и intergenic genomic последовательностей гена богатые и активно транскрибируется регионов27,40.

Существует множество описанных подходов для определения меняющихся моделей метилирования ДНК в клетки41,42,,4344,45,46, некоторые из них включение количественная оценка глобальных изменений метилирования в то время как другие упором на точные изменения в ВПУ богатых регионах промоутеров и усилители. Методы для выявления и количественной оценки 5hmC были также сообщили47, включая иммуногистохимия13. Иммуногистохимические методы, позволяющие надежный мониторинг 5мс и 5hmC изменений в ядрах развивающихся и Постмитотические клетки, очень информативным для разграничения хроматина динамика в situ в ответ на внешние или внутренние изменения влияющие ячейки4,13,48,49. Однако этот подход является склонной к недооценке метилирование ДНК и hydroxymethylation изменения из-за технических трудностей, связанных с обнаружением цитозина изменения в гистологических препаратов. Это потому, что неполярных ДНК баз, 5МС, включая и 5hmC-модифицированные цитозина скрыты внутри центр двуцепочечной ДНК helix50и требуют разоблачения. Это особенно сложным в замороженных гистологические препараты, которые могут быстро потерять информационные организации оригинальные ткани при применении жестокого обращения.

Мышь сетчатки является прекрасной моделью для того чтобы рассечь вклад метилирования нейронных развития и Постмитотические гомеостаза. Есть только 6 типов нейронов (род и конус фоторецепторов, Амакриновые, биполярный, горизонтальные и ганглий клетки), тип один из глиальных клеток (Мюллер глии) и один нейроэпителиальных клетки типа (пигментный эпителий сетчатки)51. Типы клеток сетчатки, как сообщалось, имеют различные структуры ДНК метилирования18,19, которая недавно была изучена в сингл база резолюции1,5,9,12. Недавно мы сообщили иммуногистохимия приложения для разграничения 5мс структура распределения в ядрах клеток сетчатки и изменения в ядрах взрослых мыши сетчатки, где все три methyltransferases ДНК были удалены по условной ориентации 7. по сравнению с числом докладов, где присутствие метилирование ДНК в клетки сетчатки может рассматриваться только как позитивный или негативный сигнал в hypermethylated клетки проходят apoptosis, наш подход позволил выявления конкретных хроматину расположение в пределах сетчатки клеточных ядер, которые мы и несколько групп сообщили и обсуждали ранее5,6,7,18,19,36 , 52. здесь, мы описываем иммуногистохимический (IHC) техника обнаружения 5мс и 5hmC в замороженных параформальдегида Исправлена Гистологические срезы в деталях также, как показывают данные, которые мы смогли воспроизвести от нашего первоначального доклада7 .

Protocol

Все процедуры с мышей были выполнены в соответствии с протоколами утвержденных Комитетом Детская больница Окленд научно-исследовательский институт животных ухода и использования и присоединились к ассоциации исследований в видение и офтальмологии (Арво) инструкции для использования животных в офтальмологических и видение исследования. 1. ткань подготовка к иммуноокрашивания Усыпить мышей C57 BL/6J в эмбриональных день (E) 16, послеродовой (P) 0, P15 и P90 углекислого газа (CO2) следуют обезглавливание (Е16 и P0 мышей). Сразу enucleate мыши глаза прокола иглой сметы 1/2 на спинной стороне глаза. Инкубируйте 5 минут (минимум) в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) фосфат амортизированное saline (ПБС) рН 8,0 при комнатной температуре. Чтобы сделать глаза чашки от P0, P15 и P90, вскрыть из роговицы и объектив с тонкой офтальмологический ножницы, пока глаза в 4% PFA.Примечание: Пропустить этот шаг для E16 глаза, как глаза слишком малы. Исправить глаза чашки (P0, P15 и P90) и весь глаз (Е16) в 4% PFA для 20 мин при комнатной температуре. Затем промойте глаза чашки и все глаза дважды в 1 мл ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре. Cryoprotect глаза чашки и все глаза в 1xPBS, рН 8.0 содержащие сахарозу 10% за 1 час. Держите в 20% сахарозы в однократном ПБС за 1 час и затем насыщают в 30% сахарозы в однократном ПБС на ночь при 4 ° C. На следующий день, вставлять глаза чашки и все глаза в оптимального раскроя температура смеси (OCT), (500 мкл) в cryomolds, оснастки замораживание в ванне с сухим льдом/этанол и хранить при температуре-80 ° C. Удаление прессформы с встроенный глаза чашки и весь глаз от-80 ° C и позволяют сбалансировать до-20 ° C за 1 час до cryosectioning. Вырезать сетчатки сечений (толщиной 12 мкм) параллельно оси temporonasal через голову зрительного нерва, используя криостата при-20 ° C. Смонтировать разделы сетчатки на Микроскоп слайды53 и хранить при температуре-80 ° C. 2. иммуноокрашивания с 5-mC и 5-hmC антитела Окружить сетчатки разделы смонтированы на слайдах с ручкой гидрофобный барьер. Гидрофобный барьер ручка уменьшает объем необходимых для пятен на ткани антитела. Вымойте сетчатки разделы с 200 мкл ПБС втечение 10 мин. Разрушения сетчатки разделы с 200 мкл 0,1% тритон X-100 в однократном ПБС (PBS-T) для 10 мин при комнатной температуре. Денатурируйте сетчатки разделы для 30 минут с 200 мкл, свежеприготовленные 2 N (HCl) соляной кислоты в однократном ПБС в инкубаторе 37 ° C.Примечание: Внимательно титрования HCl лечения необходимо оптимизировать 5мс сигнала. Всегда включайте биологических реплицирует (3-4) при оптимизации 5мс сигнала54.Примечание: Мы сделали поиска антигена в 4 точках времени (15 мин, 30 мин, 1 час и 2 h) и инкубации нашли 30 мин является оптимальным для 5мс сигнала. Длиннее инкубации с HCl ухудшается структура ядра приводит к невозможности локализации 5мс сигнал к ядру. После denaturation, нейтрализовать сетчатки секции, добавив 100 мкл 0.1 М трис-HCl (рН 8.3) на сетчатки секции за 10 мин. Инкубировать разделы в 500 мкл преграждая разрешение (5% preimmune нормальной козьего сыворотки в 0,1% тритон X-100 в однократном ПБС) за 1 ч при комнатной температуре в камере влажности. После блокирования, добавить анти 5мс; антител анти 5hmC развести 1: 500 в блокировании решения секции сетчатки. Инкубируйте сетчатки, разделы ночь при 4 ° C в камере влажности. Следующий день мыть, сетчатки секции 3 раза (10-15 минут каждый раз) с 0.1% PBS-T и затем инкубировать в блокировании решение с соответствующей вторичные антитела (коза анти кролик и коза анти мыши IgG, разбавленный; 1: 1000), содержащий DAPI (4′, 6 – раствор (1 мкг/мл) diamidino-2-phenylindole) при комнатной температуре в течение 1 ч в преграждая разрешение.Примечание: Избегайте сушки разделов на всех этапах immunodetection. Вымойте слайды три время с 1 мл 0,1% PBS-T. После последнего мыть смонтировать разделы с среднего водный монтаж под coverslip и печать с бесцветным лаком. 3. конфокальный иммуногистохимии Ориент разделы иметь сетчатки пигментного эпителия сторону глазного бокала всегда сталкиваются с одним способом (например, вверх), для обеспечения согласованности. Выполните захват изображения участков immunostained сетчатки на 63 X (увеличение объектива) с 2 X или 3 X зумом. Создание нескольких оптических разделы каждого выбранного изображения (z-стеки) в всех 3 канала (красный, зелёный и синий, RGB) используя шаг 0,35 мкм.Примечание: Окончательное увеличение образца визуализирована на 10-20 X (увеличение объектива) будет 63 X, соответственно, в сочетании с (обычно используется) 10 X глазной линзы.Визуализировать сжатый стек оптических найти 5мс и 5hmC сигнал

Representative Results

Чтобы определить распределение 5-метилцитозин (5мс) и 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC) во время разработки сетчатки и в Постмитотические сетчатки, мы immunostained C57BL/6J мыши сетчатки секции из E16, P0, P15 и P90 с антител специфических 5мс и 5hmC. В E16 5мс пятнать был силен в chromocenters клеточных ядер, когда слабый окрашивание было отмечено в клеточных ядрах (рис. 1a). Окрашивание 5hmC ограничивается клеточных ядер и отсутствовал из chromocenters (рис. 1b). В сетчатке P0 5мс сигнал был локализован на chromocenters клеточных ядер и ядерной периферии (Рисунок 2a, стрелка и стрелки). Мы также наблюдается слабый пятнать 5мс между chromocenters клеточных ядер. 5hmC сигнал был сильно в клеточных ядер, за исключением chromocenters (рис. 2b). Мы обнаружили, что больше ядер запятнаны с 5мс и 5hmC в neuroblast внутренний слой (INBL) (рис. 2 c, пунктирная линия) Мы нашли в сетчатке P15, сильное окрашивание 5мс и 5hmC в наружный слой ядерной (ONL), внутренний ядерный слой (INL) и слоя клеток ганглия (GCL) (рис. 3). В ONL (род фоторецепторных клеток) 5мс сигнал был в chromocenters клеточных ядер и ядерной периферии (цифры 3А-3 c, 3 g). 5hmC сигнал был найден в клеточных ядрах за исключением chromocenters (цифры 3d-3f). Сделано на сетчатке P15 просвечивающей электронной микроскопии показывает распределение гетерохроматиновые доменов в род клеточных ядер схожа с 5мс антитела сигнала (рисунки 3 h и 3i). Пятнать 5мс INL и GCL был силен в chromocenters клеточных ядер и слабых пятнать наблюдалось также в клеточных ядер (цифры 3j-3 l и 3r-3Т). В противоположность, 5МС 5hmC сигнал был локализован для клеточных ядер, за исключением chromocenters INL и GCL (цифры 3 m-3o и 3u-3w). Мы наблюдали сильный сигнал 5hmC на периферии GCL клеточных ядер. В взрослых стержень фоторецепторов 5мс сигнал был ограничивается chromocenter и ядерной периферии клеточных ядер (цифры 4a-4 c), в то время как сигнал 5hmc сводится к ядерной периферии (рисунки 4 d-4f). Рисунок 1. Локализация 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин в сетчатке мыши эмбриональные день 16.Иммуноокрашивания C57BL/6J сетчатки с антителами к 5мс (красный) и 5hmC (зеленый, b). В E16 5мс сигнал является очень сильным в chromocenters клеточных ядер и также присутствует в клеточных ядер на гораздо более низком уровне. 5hmC окрашивание сводилось исключительно к клеточных ядер. C Группа представляет объединенные 5мс и 5hmC изображения. Ядра counterstained с DAPI (синий, c). Вставками представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображениях. Линейки: 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Иммуногистохимическое окрашивание 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин в сетчатке мыши на послеродовой день 0.Immunolabeling C57BL/6J сетчатки с антителами к 5мс (красный) и 5hmC (зеленый, b). В сетчатке P0 5мс и 5hmC присутствуют в наружный neuroblast слой (ONBL) и внутренняя neuroblast слой (INBL). ) сигнал 5мс сильно присутствует в chromocenters (стрелка) и ядерной периферии клеточных ядер (стрелки). Слабая пятнать 5мс наблюдается также между chromocenters клеточных ядер. b) 5hmC окрашивание сводится к ядру клетки и в INBL (пунктирная линия на панели c) наблюдается сильный сигнал. C Группа представляет объединенные 5мс и 5hmC изображения. Ядра counterstained с DAPI (синий, c). Вставками представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображениях. Линейки: 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. На рисунке 3. 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин распределение в мыши сетчатки на послеродовой 15 день.Иммуноокрашивания C57BL/6J сетчатки с анти 5мс и 5hmC антител (a-g, j-y). В ядерный слой (ONL) (стержень фоторецепторных клеток), 5МС сигнала (красный,) обычно совпадает с chromocenters клеточных ядер (стрелки, b) и также локализуется на ядерной периферии (стрелки, b). Группа b (красный) и c (серый) представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображении. Сигнал 5hmC (зеленый, d) ограничивается клеточных ядер, за исключением chromocenters. Группа e (зеленый) и f (серый) представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображении d. Группа g представляет объединенные 5мс и 5hmC изображения. Ядра counterstained с DAPI. Группа h и являются передачи изображения микроскопа фоторецепторных ядер на послеродовой день 15 показаны распределения гетерохроматиновые доменов. Черные стрелки в Панель h указывает на один род фоторецепторных ядро расширен в группе i. красный стрелки на панели, которую я указать на гетерохроматиновые домены внутри стержня фоторецепторных ядро, в то время как красные стрелки указывают гетерохроматин ядерной периферии. В инл (j-q) и GCL клеточных ядер (r-y) 5мс сигнал (красный) локализуется в chromocenters присутствует в периферии и слабых пятнать обнаруживается также в остальной части клеточных ядер. Группа k (красный) и я (серый) представляют собой увеличение площади показано звездочкой в j изображения. 5hmC окрашивание (зеленый) в ядрах клеток INL и GCL ограничивается всего клеточного ядра. Обратите внимание, сильный 5hmC окрашивание в ядерной периферии клетки GCL. Группа p и x представляют собой объединенные 5мс и 5hmC изображения, в то время как группа q и y представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображения p и x соответственно. Ядра counterstained с DAPI. Линейки: 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин распределение в ядрах фоторецепторных стержень C57BL/6J мыши сетчатки на послеродовой день 90.Пятнать 5мс (красный,) сильно присутствует в chromocenter клеточных ядер, а также слабо подарок в ядерной периферии. Группа b (красный) и c (серый) представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображении. Окрашивание 5hmC (зеленый, d) ограничивается исключительно ядерной периферии группа e (зеленый) и f (серый) представляют собой увеличение площади показано звездочкой в изображении d. Группа g представляет объединенные 5мс и 5hmC изображения во время группа h является увеличение площади, показано с звездочка на изображении, которое g. ядер counterstained с DAPI (синий). Линейки: 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Метилирование ДНК и hydroxymethylation являются динамичной и обратимым ДНК модификации, которые modulatethe разнообразных биологических механизмов в развивающихся, а также как постмитотических клеток. Здесь мы описываем воспроизводимый метод для обнаружения 5мс и 5hmC ДНК изменения в situ иммуногистохимическим методом (с использованием антител анти 5мс и анти 5hmC) в параформальдегида Исправлена Замороженные разделы мыши сетчатки и предоставить руководящие принципы для улучшения и стандартизации результаты, особенно при сравнении несколько различных образцов. Мы раньше использовали этот метод для определения 5мс изменения в сетчатке мыши с сетчатки конкретной ориентации Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b ДНК метилтрансфераза генов и сообщил (ожидаемые) истощение 5мс знаков в их сетчатки7 .

Важнейшим шагом в 5мс Иммуногистохимическое определение является оптимизация лечения Гистологические срезы с HCl: меньш чем 15 мин Предварительная обработка не будет производить воспроизводимые результаты, в то время как чрезмерное лечение с HCl разрушает ядерной Архитектура. Мы нашли лучший результат после 30 минут инкубации с HCl. Мы рекомендуем всегда использовать свежую разреженных HCl и свежеприготовленный раствор 4% PFA для фиксации ткани ДНК денатурации и сетчатки.

Чтобы устранить результаты, мы рекомендуем включить три или четыре биологических реплицирует при оптимизации 5мс сигнала. Хотя каждый набор иммуногистохимическое окрашивание может генерировать немного разные результаты (более или менее ярко гетерохроматиновых), который ожидается в иммуногистохимических метод, 5МС и 5hmC ядерного распространения в наборе отдельных разделов, как ожидается, будет легко воспроизводимые, для, а затем протокол.

Этот метод также имеет ограничение, как мы постоянно наблюдали изменчивости распределения 5мс в ядрах фоторецепторных клеток в том же разделе. Мы нашли некоторые ядра, показал сильный 5мс сигнал в то время как соседние клеточных ядер показан сигнал не 5мс. Это обусловлено ограничением в разоблачении 5мс антигена HCl лечение в Замороженные разделы.

Значимость этой техники позволяет 5мс локализации без DNase и протеиназы K лечения приводит к лучшей сохранности chromocenters. Эта техника энергично работать на любых участках от всех позвоночных животных тканей, перевозящих 5мс, 5hmC знаки и обработаны с аналогичный подход, не только мыши сетчатки, для, а затем протокол.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materials

Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Tags

Immunohistochemistry5-methylcytosine5-hydroxymethylcytosineMouse RetinaRetinal DevelopmentChromatinFrozen Histological PreparationCryosectioningImmunostainingDNA Methylation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image