Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.
Die Epigenetik der retinalen Entwicklung ist eine gut untersuchte Forschungsfeld, das verspricht, bringen eine neue Ebene des Verständnisses über die Mechanismen der unterschiedlichsten menschlichen degenerativen Netzhauterkrankungen und neue Behandlungsansätze zu lokalisieren. Die nukleare Architektur der Maus Netzhaut gliedert sich in zwei verschiedenen Mustern: konventionelle und umgekehrt. Konventionellen Muster ist universell, wo Heterochromatin lokalisiert an der Peripherie des Zellkerns, während aktive Euchromatin im nuklearen inneren wohnt. Im Gegensatz dazu ist invertiert nuklearen Muster nur für die Erwachsenen Stab Photorezeptor Zellkerne Heterochromatin, das nukleare Zentrum lokalisiert, wobei Euchromatin befindet sich in der nuklearen Peripherie. DNA-Methylierung wird überwiegend im Chromocenters beobachtet. DNA-Methylierung ist eine dynamische kovalente Modifikation auf die Cytosin-Rückstände (5 Methylcytosine, 5mC) von CpG dinucleotid, die in den Regionen Förderer vieler Gene angereichert sind. Drei DNA-Methyltransferasen (DNMT1, DNMT3A und DNMT3B) in der Methylierung der DNA während der Entwicklung zu beteiligen. Erkennung von 5mC mit immunhistochemischen Techniken ist eine große Herausforderung, einen Beitrag zur Variabilität der Ergebnisse, da alle DNA-Basen, einschließlich 5mC geändert Basen innerhalb der doppelsträngigen DNA-Helix verborgen sind. Detaillierte Darstellung der 5mC Verteilung während der Entwicklung ist jedoch sehr informativ. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik für robuste immunhistochemischen Nachweis von 5mC und eine weitere epigenetische DNA-Marker 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), die mit der “offenen”, transcriptionally aktiv Chromatin bei der Entwicklung von colocalizes und postmitotischen Maus Netzhaut.
Epigenetischen Regulation von Entwicklung und postmitotischen Homöostase der Maus Netzhaut ist ein spannender Bereich der Forschung, welche verspricht eine neuartige Verständnis der biologischen Mechanismen, die Steuerung von Retinogenesis und Zelle Schicksal Bestimmung, bringen Zelle typspezifischen Stoffwechselfunktionen sowie Zelle Pathologien, Zelltod und Regeneration1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Chromatin erfährt dynamische Veränderungen in der Entwicklung sowie als Reaktion auf Variable externe Signale, sei es stress, metabolischen oder Zelle Tod Reize6,14,15, 16 , 17 , 18. in Maus Kerne Chromatin gliedert sich in aktive Euchromatin und inaktive Heterochromatin6,19,20. In Interphase Nucleus wohnt Euchromatin im inneren Bereich des Kernes während Heterochromatin der nuklearen Peripherie und Nukleolus Linien. Dieses Muster wird als konventionelle und ist hoch konserviert in den Eukaryotes. Im Gegensatz dazu haben Stab Kerne in nachtaktive Tiere wie Maus und Ratte Muster invertiert, wo der Kern von Heterochromatin in der Mitte umgeben von Euchromatin bildet die äußerste Schale6,18besetzt ist, 20. Bei der Geburt haben die Rute Kerne konventionellen nuklearen Architektur. Umkehrung der Rute Kerne erfolgt während der Entwicklung durch Umbau von konventionellen und nuklearen Architektur. Während dieses Prozesses periphere Heterochromatin trennt von der nuklearen Peripherie und Chromocenters verschmelzen zu einer einzigen Chromocenter in der Mitte der Kern6,18.
Genomische DNA-Methylierung beteiligt sich bei der Kontrolle der lokalen Chromatin Konformation21. DNA-Methylierung tritt an der 5′ Position von Cytosin Rückständen von CpG dinucleotid, die angereichert sind in der Promotorregion vieler Gene in der Maus Genome22,23,24,25,26 sowie in intergenetischer und Intron-Regionen, die regulatorische Elemente27tragen. Methylierung von CpG Inseln im proximalen Promotoren21,24 und CpG-Sequenzen in gen Enhancer27,28 ist wichtig bei der Regulation der dynamische Zustand des bivalenten Chromatin, mit vielen Developmental Gene/Transkription Faktoren spielen wichtige Rolle bei der Entwicklung, Krebs und Altern29,30,31,32,33,34 . DNA-Methylierung bei Maus Entwicklung35beteiligen sich drei DNA-Methyltransferasen (DNMTs). Alle drei DNMTs sind während Maus retinalen Entwicklung36 und Netzhaut-spezifische Änderungen in Dnmt Gene Auswirkungen retinalen Entwicklung2,7zum Ausdruck gebracht. Hydroxymethylcytosine (5hmC) resultiert oxidative Demethylierung 5-Methylcytosine (5mC). Die drei zehn-elf Translokation (TET) Enzyme beteiligt 5mC Demethylierung37,38,39. Hydroxymethyl-C Modifikation wird in Promotoren, gen Körpern und intergenetischer Genomsequenzen innerhalb gen reichen und aktiv transkribierten Regionen27,40bereichert.
Es gibt eine Vielzahl der beschriebenen Ansätze zur Bestimmung der veränderten Methylierungsmuster der DNA in Zellen41,42,43,44,45,46, einige davon ermöglichen Quantifizierung der globale Veränderungen der DNA-Methylierung, während andere mit Schwerpunkt auf präzise Änderungen in CpG-reiche Regionen Promotoren und Geschmacksverstärker. Methoden für die Erkennung und Quantifizierung von 5hmC wurden auch berichteten47, einschließlich von Immunohistochemistry13. Immunhistochemischen Techniken, die robuste Überwachung der 5mC und 5hmC Veränderungen in Kernen der Entwicklung ermöglichen und postmitotischen Zellen sind sehr informativ für die Abgrenzung Chromatin Dynamik in Situ in Reaktion auf externe oder interne Änderungen Auswirkungen auf die Zellen4,13,48,49. Dieser Ansatz ist jedoch anfällig für DNA-Methylierung und Hydroxymethylation Änderungen aufgrund technischer Probleme, verbunden mit Erkennung von Cytosin Änderungen in histologische Präparate zu unterschätzen. Deshalb, weil die unpolaren DNA-Datenbanken, einschließlich 5mC und 5hmC geändert Cytosin, in der Mitte der doppelsträngigen DNA-Helix50versteckt sind und erfordern entlarven. Dies ist eine besondere Herausforderung im gefrorenen histologische Präparate, die schnell informativ Organisation des ursprünglichen Gewebes verlieren können, wenn harte Behandlung angewendet wird.
Die Maus Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Modell, den Beitrag der DNA-Methylierung neurale Entwicklung und postmitotischen Homöostase zu zergliedern. Es gibt nur 6 Arten von Neuronen (Stab und Zapfen-Photorezeptoren, amakrinen, Bipolarzellen, Horizontal “und” Ganglion), einem glialen Zelltyp (Muller Glia) und ein neuroepithelialer Zell-Typ (retinale Pigmentepithel)51. Netzhaut Zelltypen wurden berichtet, unterschiedliche Muster der DNA-Methylierung18,19, haben die vor kurzem bei Single-Base Auflösung1,5,9,12untersucht worden. Wir berichteten vor kurzem Immunohistochemistry Anwendung zur Abgrenzung 5mC Muster der Verteilung innerhalb der Kerne der netzhautzellen und Veränderungen in den Kernen der Erwachsenen Maus Netzhaut, wo alle drei DNA-Methyltransferasen durch bedingte gezielte entfernt wurden 7. im Vergleich zu einer Reihe von Berichten, wo das Vorhandensein von DNA-Methylierung in netzhautzellen konnte nur als positiv betrachtet werden oder negatives Signal in Hypermethylated Zellen in Apoptose, aktiviert unsere Vorgehensweise erkennen spezifische Chromatin Anordnung innerhalb der Netzhaut Zellkerne, die wir mehrere Gruppen berichtet und erläuterten5,6,7,18,19,36 , 52. hier beschreiben wir die immunhistochemische (IHC) Technik 5mC und 5hmC ebenso wie die Daten zeigen, die wir Ihnen aus unserer ursprünglichen Bericht7 reproduzieren konnten in gefrorenen Paraformaldehyd fixiert histologischen Abschnitten im Detail erkennen .
DNA-Methylierung und Hydroxymethylation sind dynamisch und reversible DNA-Modifikationen, welche Modulatethe vielfältigen biologischen Mechanismen in einem Entwicklungsland ebenso wie in postmitotischen Zellen. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik zur Erfassung von 5mC und 5hmC DNA-Modifikationen in Situ durch immunhistochemische Technik (mit Anti-5mC und Anti-5hmC Antikörper) in Paraformaldehyd fixiert Gefrierschnitte Maus Netzhaut, und bieten Richtlinien für die Verbesserung und Standardisierung der Ergebnisse, vor allem, wenn mehrere verschiedene Proben zu vergleichen. Wir früher verwendet diese Methode, 5mC Veränderungen der Netzhaut Maus mit Netzhaut-spezifische Ausrichtung der Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b DNA Methyltransferase Gene abzugrenzen, und berichtet von der (voraussichtlichen) Erschöpfung der 5mC Marken in ihre Netzhaut7 .
Der entscheidende Schritt in 5mC immunhistochemischen Nachweis ist die Optimierung der Behandlung von histologischen Schnitten mit HCl: weniger als 15 min Vorbehandlung voraussichtlich nicht reproduzierbaren Ergebnissen, während übermäßige Behandlung mit HCl die nukleare zerstört Architektur. Wir fanden beste Ergebnis nach 30 min Inkubation mit HCl. Wir empfehlen, immer frisch verdünnte HCl und frisch zubereiteten 4 % PFA Lösung für DNA Denaturierung und retinalen Gewebes Fixierung verwenden.
Um die Ergebnisse zu beheben, wird empfohlen, drei bis vier biologischen Wiederholungen bei gleichzeitiger Optimierung 5mC Signal aufzunehmen. Während jeder einzelne von Satz kann immunhistochemische Färbung leicht unterschiedliche Ergebnisse (mehr oder weniger hellen heterochromatischen Regionen), erzeugen die immunhistochemische Methode und der 5mC 5hmC nuklearen Verteilung innerhalb der einzelnen erwartet der Abschnitte werden voraussichtlich für sehr reproduzierbar sein, solange das Protokoll gefolgt ist.
Diese Technik hat auch Einschränkung, da wir konsequent Variabilität in 5mC Verteilung in der Photorezeptor Zellkerne innerhalb des gleichen Abschnitts zu beobachten. Wir fanden einige Kerne zeigte starke 5mC Signal während angrenzenden Zellkerne kein 5mC Signal zeigte. Dies ist aufgrund der Einschränkung in Demaskierung 5mC Antigen durch HCl Behandlung in Gefrierschnitte.
Die Bedeutung dieser Technik ermöglicht 5mC Lokalisierung ohne DNase und Proteinase K-Behandlung führt zu besseren Schutz der Chromocenters. Diese Technik ist robust auf alle Abschnitte von allen Wirbeltieren tierischen Geweben, tragenden 5mC, 5hmC Marken arbeiten und mit einen ähnlichen Ansatz, nicht nur Maus Netzhaut für verarbeitet, solange das Protokoll gefolgt ist.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SBIR Zuschuss (1R44EY027654-01A1).
Supplies | |||
29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Reagent | |||
Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
5hmC | Active Motif | 39791 | |
LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
Equipment | |||
MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
Confocal microscope | Zeiss |