Neurogenèse à l'aide de cellules de carcinome embryonnaire P19
Summary
La lignée cellulaire embryonnaire de carcinome de souris P19 (ligne cellulaire P19) est largement utilisée pour étudier le mécanisme moléculaire de la neurogenèse avec une grande simplification par rapport à l’analyse in vivo. Ici, nous présentons un protocole pour la neurogenèse acide-induite rétinoïque dans la ligne de cellules de P19.
Abstract
La lignée cellulaire P19 dérivée d’un tératocarcinome dérivé de l’embryon de souris a la capacité de se différencier en trois couches germinales. En présence d’acide rétinoïque (RA), la lignée cellulaire P19 cultivée en suspension est induite pour se différencier en neurones. Ce phénomène est largement étudié comme un modèle de neurogenèse in vitro. Par conséquent, la lignée cellulaire P19 est très utile pour les études moléculaires et cellulaires associées à la neurogenèse. Cependant, les protocoles pour la différenciation neuronale de la lignée cellulaire P19 décrite dans la littérature sont très complexes. La méthode développée dans cette étude est simple et jouera un rôle dans l’élucidation des mécanismes moléculaires dans les anomalies neurodéveloppementales et les maladies neurodégénératives.
Introduction
Pendant le développement embryonnaire, une seule couche cellulaire est transformée en trois couches germinales distinctes1,2,3. Pour augmenter les possibilités de recherche des phénomènes se produisant in vivo, la génération d’agrégats tridimensionnels (corps embryonnaires) a été développée comme modèle pratique. Les agrégats cellulaires formés de cette façon peuvent être exposés à diverses conditions causant la différenciation cellulaire, qui reflètent le développement de l’embryon4,5. La lignée cellulaire embryonnaire de carcinome murine P19 (lignée cellulaire P19) est couramment utilisée comme modèle cellulaire pour les études de neurogenèse in vitro6,7,8. La lignée cellulaire P19 présente des caractéristiques typiques des cellules souches pluripotentes et peut se différencier en neurones en présence d’acide rétinoïque (RA) lors de l’agrégation cellulaire suivie d’une excroissance neurite dans des conditions adhérentes. En outre, la lignée cellulaire Indifférenciée P19 est également capable de former des cellules musculaires et cardiomyocytes sous l’influence du sulfoxyde de diméthyle (DMSO)9,10,11,12.
Beaucoup de méthodes13,14,15,16 ont été signalées pour la différenciation neuronale, mais la méthodologie est parfois compliquée et pas facile à saisir en lisant seulement les descriptions. Par exemple, les protocoles exigent parfois une combinaison du milieu moyen d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un mélange de sérum de veau (CS) et de sérum bovin foetal (FBS)13. En outre, les médias utilisés pour le développement neuronal sont souvent composés de neurobasal et B27 suppléments13,14,15,16. En tant que tel, les méthodes existantes contiennent de la complexité dans leur préparation et notre objectif ici est de simplifier les protocoles. Dans cette étude, nous avons démontré que dMEM avec FBS peut être utilisé pour maintenir la lignée cellulaire P19 (DMEM – 10% FBS) ainsi que pour le développement neuronal (DMEM – 5% FBS – RA). Cette méthode simplifiée pour la neurogenèse utilisant la lignée cellulaire P19 nous permet d’étudier le mécanisme moléculaire de la façon dont les neurones sont développés. En outre, la recherche sur les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer est également menée en utilisant la lignée cellulaire P1917,18, et nous croyons que la méthode développée dans cette étude jouera un rôle dans l’élucidation de la mécanismes moléculaires dans les anomalies neurodéveloppementales et les maladies neurodégénératives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un protocole simple pour la neurogenèse utilisant la ligne cellulaire de P19. Bien que de nombreux rapports aient été publiés à cet égard, une méthodologie détaillée pour l’induction de neurogenèse utilisant la lignée cellulaire De P19 demeure peu claire. En outre, nous avons utilisé un simple high glucose (4,500 mg/L) milieu DMEM avec 10% FBS pour l’ensemble de l’expérience. Cela nous a permis d’effectuer l’expérience neurogène d’une manière conviviale et d’élargir l’utilisation de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été soutenue financièrement par le Centre national des sciences, Pologne (accord no. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) et KNOW (Leading National Research Centre) Consortium scientifique “Healthy Animal – Safe Food”, décision du ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur No 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
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