Нейрогенез с использованием P19 эмбриональных клеток карциномы
Summary
Линия эмбриональной карциномы P19 мыши (линия клеток P19) широко используется для изучения молекулярного механизма нейрогенеза с большим упрощением по сравнению с анализом in vivo. Здесь мы представляем протокол для ретинойной кислоты индуцированного нейрогенеза в линии клеток P19.
Abstract
Линия клеток P19, полученная из тератокарциномы эмбриона, полученного из эмбриона мыши, имеет способность дифференцироваться в три слоя микробов. При наличии ретинойной кислоты (РА), суспензия культивируемая линия клеток P19 индуцируется, чтобы дифференцироваться в нейроны. Это явление широко исследуется как модель нейрогенеза in vitro. Таким образом, линия клеток P19 очень полезна для молекулярных и клеточных исследований, связанных с нейрогенезом. Тем не менее, протоколы для нейрональной дифференциации линии клеток P19, описанные в литературе, очень сложны. Метод, разработанный в этом исследовании, прост и будет играть определенную роль в выяснении молекулярных механизмов в нейроразвития аномалий и нейродегенеративных заболеваний.
Introduction
Во время эмбрионального развития одноклеточный слой превращается в три отдельных слоя зародыша1,2,3. Для расширения возможностей исследований явлений, происходящих в vivo, в качестве удобной модели были разработаны генерации трехмерных агрегатов (эмбриональных тел). Сотовые агрегаты, образующиеся таким образом, могут подвергаться воздействию различных условий, вызывающих дифференциацию клеток, которые отражают развитие эмбриона4,5. P19 murine эмбриональной линии клеток карциномы (P19 клеточной линии) обычно используется в качестве клеточной модели для нейрогенеза исследований в пробирке6,7,8. Линия клеток P19 демонстрирует типичные плюрипотентные черты стволовых клеток и может дифференцироваться в нейроны в присутствии ретинойной кислоты (РА) во время агрегации клеток, а затем невритовый рост в условиях адепта. Кроме того, недифференцированная линия клеток P19 также способна формировать мышечно-и кардиомиоцитоподобные клетки под воздействием диметилсульфида (ДМСО)9,10,11,12.
Многие методы13,14,15,16 были зарегистрированы для нейронной дифференциации, но методология иногда сложна и не легко понять, только читая описания. Например, протоколы иногда требуют комбинации Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) среды дополнены смесью сыворотки икры (CS) и сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS)13. Кроме того, средства массовой информации, используемые для развития нейронов часто состоят из Neurobasal и B27 добавки13,14,15,16. Таким образом, существующие методы содержат сложность в их подготовке, и наша цель здесь заключается в упрощении протоколов. В этом исследовании мы продемонстрировали, что DMEM с FBS может быть использован для поддержания линии клеток P19 (DMEM и 10% FBS), а также для развития нейронов (DMEM 5% FBS и RA). Этот упрощенный метод нейрогенеза с использованием линии клеток P19 позволяет нам изучать молекулярный механизм развития нейронов. Кроме того, исследования нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера также проводится с использованием P19 клеточной линии17,18, и мы считаем, что метод, разработанный в этом исследовании будет играть определенную роль в выяснении молекулярные механизмы при нейроразвитиях и нейродегенеративных заболеваниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем простой протокол нейрогенеза с использованием линии клеток P19. Хотя многие доклады были опубликованы в этой связи, подробная методология индукции нейрогенеза с использованием линии клеток P19 остается неясным. Кроме того, мы использовали простой высокий уровень глюк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было финансово поддержано Национальным научным центром, Польша (грант нет. УМО-2017/25/N/N/N/01886) и KNOW (Ведущий национальный исследовательский центр) Научный консорциум “Здоровое животное – безопасная пища”, решение Министерства науки и высшего образования No 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
- Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
- Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
- Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).
- Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
- Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
- Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
- Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
- Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
- Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
- Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
- Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
- Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
- Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
- Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
- Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
- MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).
- Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
- Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
- Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
- Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).
