Neurogénesis con células de carcinoma embrionario P19
Summary
La línea celular de carcinoma embrionario de ratón P19 (línea celular P19) es ampliamente utilizada para estudiar el mecanismo molecular de la neurogénesis con gran simplificación en comparación con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo para la neurogénesis inducida por ácido retinoico en la línea celular P19.
Abstract
La línea celular P19 derivada de un teratocarcinoma derivado del embrión de ratón tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales. En presencia de ácido retinoico (RA), la línea celular P19 cultivada en suspensión se induce a diferenciarse en las neuronas. Este fenómeno se investiga ampliamente como un modelo de neurogénesis in vitro. Por lo tanto, la línea celular P19 es muy útil para estudios moleculares y celulares asociados con la neurogénesis. Sin embargo, los protocolos para la diferenciación neuronal de la línea celular P19 descrita en la literatura son muy complejos. El método desarrollado en este estudio es sencillo y desempeñará un papel en la esclarecimiento de los mecanismos moleculares en anomalías del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
Durante el desarrollo embrionario, una sola capa celular se transforma en tres capas de gérmenes separadas1,2,3. Para aumentar las posibilidades de investigación de los fenómenos que ocurren in vivo, la generación de agregados tridimensionales (cuerpos embrionarios) se ha desarrollado como un modelo conveniente. Los agregados celulares formados de esta manera pueden ser expuestos a diversas condiciones que causan diferenciación celular, que reflejan el desarrollo del embrión4,5. La línea celular de carcinoma embrionario de murine P19 (línea celular P19) se utiliza comúnmente como modelo celular para estudios de neurogénesis in vitro6,7,8. La línea celular P19 presenta características típicas de células madre pluripotentes y puede diferenciarse en neuronas en presencia de ácido retinoico (RA) durante la agregación celular seguida de un crecimiento de neurita en condiciones adherentes. Además, la línea celular P19 indiferenciada también es capaz de formar células similares a los músculos y cardiomiocitos bajo la influencia de dimetil sulfóxido (DMSO)9,10,11,12.
Muchos métodos13,14,15,16 se han reportado para la diferenciación neuronal, pero la metodología a veces es complicada y no es fácil de entender sólo leyendo las descripciones. Por ejemplo, los protocolos a veces requieren una combinación del medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con una mezcla de suero de ternero (CS) y suero bovino fetal (FBS)13. Por otra parte, los medios utilizados para el desarrollo neuronal se componen a menudo de Neurobasal y B27 suplementos13,14,15,16. Como tal, los métodos existentes contienen complejidad en su preparación y nuestro objetivo aquí es simplificar los protocolos. En este estudio, demostramos que DMEM con FBS se puede utilizar para mantener la línea celular P19 (DMEM + 10% FBS) así como para el desarrollo neuronal (DMEM + 5% FBS + RA). Este método simplificado para la neurogénesis utilizando la línea celular P19 nos permite estudiar el mecanismo molecular de cómo se desarrollan las neuronas. Por otra parte, la investigación sobre enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer también se lleva a cabo utilizando P19 célula según la línea17,18, y creemos que el método desarrollado en este estudio desempeñará un papel en el esclarecimiento de la mecanismos moleculares en anomalías del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo simple para la neurogénesis usando la línea celular P19. Aunque se han publicado muchos informes a este respecto, una metodología detallada para la inducción de la neurogénesis utilizando la línea celular P19 sigue sin estar clara. Además, utilizamos un medio DMEM simple de glucosa alta (4.500 mg/L) con 10% DE FBS para todo el experimento. Esto nos permitió realizar el experimento neurogénico de una manera fácil de usar y ampliar el uso de este método para el futuro.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado financieramente por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia (concesión no. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) y KNOW (Leading National Research Centre) Consorcio Científico “Animal Saludable – Alimentos Seguros”, decisión del Ministerio de Ciencia y Educación Superior No 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
References
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