低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

1. 細胞感染と DNA の抽出 培養 Huh7 おける NTCP 細胞8,9でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 胎児の牛血清 v/v、ペニシリン/ストレプトマイシンと 2 mM L グルタミン x 1 を維持します。注: これは以前報告されて詳細40。 種子 2 x 105セル/mL Huh7 おける NTCP セル DMEM の 1 ml 12 ウェル プレート。 細胞治療 (例えば、 b 型肝炎ウイルス阻害剤) をテストする場合に適用する培養上清 4 h (HBV 感染前に 1 日) を播種後。否定的な制御の適用 200 nM Myrcludex B (強力な HBV エントリー阻害剤41)。 500 μ L の培地 (v/v の 10% 牛胎児血清ペニシリン/ストレプトマイシン、2 ミリメートル L-グルタミンと 2.5 %v/v x 1 を DMEM で 1,000 VGE/セルの細胞へ感染する接種材料として HepAD3843から精製ヘパリン列42上清を使用します。DMSO) ポリエチレング 4 %w/v 8000 [1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 解散]。 (5% CO2と 90% 湿度に設定) 37 ° C の定温器の細胞を培養します。 感染 16-24 h 後に滅菌 1 × PBS の 1 mL で 2 回洗浄を行う。 次の収穫まで HBV 感染 2 日ごと文化メディアを交換します。 3 日目後感染で 5 μ M テノホビル テノホビルジソプロキシルおよび 10 μ M の細胞を扱うラミブジン無衝突 invPCR では、b 型肝炎ウイルス複製中間体の生産を制限します。 5 日目感染後、トリプシン-EDTA の 200 μ L でセルを trypsinize、DMEM (10 %v/v 胎仔ウシ血清、ペニシリン/ストレプトマイシンと 2 mM L グルタミン x 1)、また、5 μ M テノホビル テノホビルジソプロキシルと 10 μ M を含む 2 mL でそれらを再懸濁しますラミブジン。 細胞懸濁液を細胞分裂 (これは invPCR によって HBV cccDNA44と無衝突が他の HBV DNA の中間物の損失を誘発すると報告されている) の 1 つのラウンドを誘発する 6 ウェル プレートに転送します。 7 日目感染後、トリプシン-EDTA の 400 μ L で拡張された細胞を trypsinize、DMEM の 1 mL に混合物を再懸濁します。懸濁液を 1.5 mL チューブに、5 分間 500 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、吸引により、上清を除去します。 (省略可能)DNA の抽出の準備ができるまでは、-20 ° C で細胞ペレットを格納します。 製造元の指示に従って、DNA 抽出キットを使用して細胞ペレットから DNA を抽出します。光学密度測定を使用して最終的な DNA 濃度を推定します。注: 100 μ L の溶出量の DNA 収量は一般的に 250 〜 400 ng/μ L。 2. DNA の逆転 200 μ L の PCR チューブにステップ 1 から全 DNA の分注 ~1.5–2.5 μ g を抽出します。1 x ダイジェスト反応バッファーを含む 40 μ L 反応ボリュームが発生する制限酵素マスター ミックスの適切な量を追加 (e.g。、CutSmart バッファー) と 10 U下士官私-HF。 反応を徹底的にミックスし、小さな管、遠心分離機でスピンダウンします。37 ° C で最適な消化効率のために 1 時間の PCR マシンに制限酵素反応を孵化させなさい。 20 分の 80 ° c の孵化によって制限酵素を不活性化します。 1.5 mL チューブに全体の制限酵素反応を転送します。T4 DNA リガーゼ バッファーと 500 U の T4 DNA リガーゼ x 1 の 400 μ L を追加し、それを徹底的にミックスします。大きな反応量は、消化の DNA のフラグメントの (反対分子間) 分子内結紮を奨励しています。 完全な結紮を確実に 2 時間室温で ligation の反作用を孵化させなさい。 70 ° C、20 分で T4 DNA リガーゼを不活性化します。 T4 リガーゼの完全な不活化を確保するためドデシル硫酸エステル ナトリウム 10 %w/v の 10 μ L を追加します。 パルス ボルテックス チューブをミックスし、反応混合物を簡単にスピンします。100 mM とデキストラン (35-45 kDa) の最終的な集中に NaCl を 90 μ g/mL の最終的な集中に追加します。パルス ボルテックス チューブをミックスし、反応混合物を簡単にスピンします。 逆解析による 900 μ L の 100% エタノールとミックスを追加します。一晩、-20 ° C で DNA を沈殿させます。 ペレットで 14,000 x g で 15 分間の遠心分離で沈殿した DNA は、P200 ピペットで吸引により上清を削除します。15 分 14,000 x g で 70 %v/v エタノールおよび遠心分離の 500 μ L の餌を洗浄します。 P200 ピペットで吸引してエタノールを削除します。20 分間室温で DNA の餌を風乾します。 溶解ダイジェスト反応バッファー × 1、 BsiHKAI の 5 U と 5 U Sph- HF. 加温を含む 40 μ L 反応量の結果をマスター ミックス制限酵素の H2O を追加 20 μ L の 20 μ L でペレットに制限酵素反応、37 ° C ( SphHF 最適温度) 1 h でヒート ブロック。 反応混合物を簡単にスピンします。65 ° C ( BsiHKAI 最適温度) 1 h でヒート ブロックに制限酵素反応を孵化させなさい。 反応混合物を簡単にスピンします。 次のステップまで-20 ° C で倒立の DNA を格納します。 3. nested pcr 法 DNA 劣化ソリューションを使用して再利用可能なシリコン マット シールから潜在的な産物を削除、徹底的に DNA 無料水でマットを洗い、PCR の混合物を準備しながら室温でそれを空気乾燥します。 外側前方を含む 1 x PCR ミックス 1 mL を準備 (5′-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3′) および逆引き (5′-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3′) 0.5 μ M の濃度でプライマー。 A1 と E1 の井戸 96 ウェル PCR プレートに 1 x PCR ミックスの 170 μ L を追加します。 H1 に井戸 B1 に 1 x PCR ミックスの 120 μ L を追加します。 A1 と E1 の井戸にステップ 2 から逆の DNA の 10 μ L を追加 (同じ PCR プレートには 2 種類の反転サンプルを分析できます)。ミックス各約 10 倍を軽くピペッティングによる各ウェルに反応は、100 μ L に設定 P1000 を使用しています。 連続希釈サンプルは、A1 D1 からを 1:3 の割合で各ステップで 60 μ L を転送することによって井戸します。優しくそれらを 100 μ L に設定 P1000 を使用して 10 回のピペッティングにより各ステップで井戸をミックスします。気泡を形成しないでください。よく H1 まで希釈も E1 の手順 3.6 を繰り返します。 96 ウェル プレートの A12 H12 井戸に到達するまでに井戸 A2 H2、H3-A3 に井戸 A1 H1 からマルチ チャンネル ピペットを使用する反応液の分注 10 μ L。ステップ 3.1、しっかりと押してから乾燥シリコン マット PCR プレートをカバーします。 PCR マシンでプレートを置き、次のプログラムを実行: 95 ° C で 10 分間15 35 サイクル 95 ° c、15 s s 54 ° C、72 ° C、3 分72 ° C で 7 分その後、室温でプレートを保持します。 ブンゼン バーナーで真っ赤に 96 ピン レプリケーターのピンを加熱し、室温で少なくとも 5 分間冷却します。 1 x PCR ミックス (ゲル負荷用バッファーを含む) と内側の前方の 10 μ L を第 2 PCR プレートの井戸を埋める (5′-CGC ATG ギャグ ACC ACC GTG A-3′) および逆引き (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′) 0.5 μ M で。 慎重に最初のラウンド PCR から 96 ウェル プレートの PCR プレートからシリコン マットを削除、井戸間の交差汚染を避けます。 第 1 ラウンドの PCR から新しく検体の 96 ウェル プレートに 96 ウェル プレートの PCR の製品を転送するのに冷却のレプリケーターを使用します。Nested pcr 法のステップ 3.8、95 ° C で初期変性のステップを 10 分から 2 分に変更する以外同じ条件を使用して実行します。 4 PCR 製品分離とゲルの抽出 96 ウェルを用いた 1.3 w/v アガロースゲル電気泳動で PCR の製品を分析します。100 mL agarose のゲルを 10-15 分の 200 V で実行します。 使い捨てストローを使用して agarose のゲルからの DNA バンドを切除します。各 PCR の製品のわらを置き、agarose のゲルを 1.5 mL チューブに差し込み、サイズにわらをハサミでトリミングします。注: 単一の PCR の製品を解決できるこれらの希釈からだけのバンドを分離するで十分です。 (省略可能)後で抽出するための-20 ° C でチューブを格納します。 各チューブにわらのフラグメントの端に押し込んでアガロース プラグを取り出します。各チューブにゲル抽出バッファーの 300 μ L、5 μ L のゲル抽出ガラス ビーズ スラリーを追加します。 (半分ボリュームを使用して、手順を洗浄するため) を除くゲル抽出キットの製造元の指示に従って PCR の製品を抽出し、30 μ L の水とビーズから DNA を溶出します。 サンガーの浄化された DNA を提出と 2 番目のラウンドで使用される前方のプライマー (仕入先の指示) に従ってシーケンス ネスト PCR。 5. シーケンス解析 ブラストと塩基配列 (全体ヌクレオチド コレクションへの位置合わせの既定の設定を使用) を実行することによってウイルス細胞の DNA 結合部位を確認します。注: 代表的な結果は以下の図 3で詳しく説明します。 高炉解析を再実行する前に 5′ HBV dna シーケンスの部分の配置を観察すると、場合にのみをトリミングします。 特定のシーケンスは次のように真の統合ジャンクションを表すかどうかを確認する厳格な選択基準が適用されます。 だけが含まれるシーケンスを含む > 20 細胞のゲノムにマッピングを自信の細胞シーケンスの bp。 10 はずのウイルス-細胞統合ジャンクション、彼らの可能性を表す体外結紮イベントとしての bp ではなく真の統合ジャンクション内で使用されるすべての酵素の制限のサイトを含むシーケンスを無視します。 シーケンス反応中に交差汚染によって生成された可能性が高い成果物は、これらシーケンス クロマト グラフになって統合ジャンクションのどちら側に明らかな異種ピーク蛍光レベルの任意のシーケンスを無視またはキャピラリー クロマトグラフィー。 これらの正確な b 型肝炎ウイルスとウイルス細胞接合部で細胞のシーケンスとして独自の統合イベントを定義します。注: 独自の統合イベントの繰り返しに起因できる PCR (の代表の結果にさらに詳細なネガティブ コントロール反応を使用してテストすることができます中にこれらの統合や相互汚染を含む細胞のクローン性増殖下記参照)。特定の細胞系列に繰り返し統合は、非相同末端結合経路が使用される15統合イベントごとに異なる HBV ターミナル サイトを表示する予定です。 反転反応に総 DNA の入力の量に正規化が続いて、その希釈で検出されたウイルス細胞ジャンクションの数による倒立 DNA テンプレートの希釈倍率を掛けて統合周波数を計算します。一般的に、統合周波数は 1:10 程度は4セル。