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Immunology and Infection

Erkennung von niedrigen Kopie Nummer integrierte virale DNA gebildet durch In-vitro- Hepatitis B-Infektion

Published: November 07, 2018
doi:
10.3791/58202
,
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory,Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Wir beschreiben hier die in-vitro- Erzeugung von HBV-DNA über eine Hepatitis B-Virus-Infektion-System und die hochempfindliche Erkennung seiner (1 – 2 Kopien)-Integration mit Inverse nested PCR.

Abstract

Hepatitis B Virus (HBV) ist eine gemeinsame Blut übertragbaren Erreger verursacht Leberkrebs und Leberzirrhose infolge chronischer Infektion. Das Virus repliziert in der Regel durch eine episomal DNA Mittelstufe; jedoch ist Integration der HBV-DNA-Fragmente in das Wirtsgenom beobachtet worden, obwohl diese Form nicht für die virale Replikation notwendig ist. Der genaue Zweck, Timing und Mechanismen durch die HBV-DNA-Integration tritt ist noch nicht klarere, aber die jüngste Daten zeigen, dass es sehr früh nach der Infektion auftritt. Hier werden die in-vitro- Erzeugung und Nachweis von HBV-DNA-Integrationen im Detail beschrieben. Unser Protokoll speziell verstärkt einzelne Kopien des Virus-Zell-DNA-Integrationen und ermöglicht absolute Quantifizierung und einzigen Basenpaar Auflösung der Kreuzung Sequenz. Diese Technik hat zu verschiedenen HBV-anfälligen Zelltypen (einschließlich primären humanen Hepatozyten), zu verschiedenen HBV-Mutanten und in Verbindung mit verschiedenen Belichtungen Medikament angewendet worden. Wir sehen diese Technik immer eine wichtige Assay die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieses klinisch relevante Phänomens zu bestimmen.

Introduction

HBV ist ein doppelsträngigen DNA-Virus, die lebenslange chronische Infektion verursachen können, führt zu einer Leberzirrhose und hepatozellulären Karzinom (HCC)1,2,3. Zwar gibt es mehrere molekulare Mechanismen fahren HBV Persistenz4 (z. B. hohe Stabilität der epigenetischen virale transkriptionelle Vorlage), Umgehung der Immunüberwachung und niedrigen Umsatz von Hepatozyten in der Leber und die damit verbundenen Risiko von HCC Einleitung5,6 (z. B. chronische Entzündungen und Aktivierung der zellulären Wege zu betonen), HBV-DNA-Integration in das Wirtsgenom Zelle (ein gemeldeten Mechanismus für beide dieser Phänomene) schlecht studiert . Ein wesentlicher Grund ist der Mangel an geeigneten in-vitro- Infektion Systeme für HBV, die zuverlässige Erkennung von Integrationsveranstaltungen ermöglichen. Hier beschreiben wir eine kürzlich entwickelte Protokoll für in-vitro- Erzeugung und Nachweis von HBV-DNA-Integrationen, die verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und deren Folgen aufzuklären.

HBV-Replikation und die Bildung der HBV-DNA-Integration hat zuvor im Detail7überprüft wurde. Kurz gesagt, tritt HBV Hepatozyten mit Natrium Taurocholate Co-transporting Peptid (NTCP) als die wichtigsten zellulären Rezeptor für Infektion8,9. Die HBV-Nucleocapsids mit HBV-entspannt zirkuläre DNA (RcDNA) tritt Genom den Zellkern, wo die RcDNA in episomal kovalent geschlossene kreisförmige DNA (CccDNA) umgewandelt. Die nukleare CccDNA fungiert als die transkriptionelle Vorlage für virale mRNAs und Pre-genomische RNA (PgRNA)10. HBV-Polymerase und PgRNA werden dann in neu gegründeten Nucleocapsids (bestehend aus HBV-Core-Protein-Dimeren) verpackt. HBV-PgRNA ist innerhalb der Nukleokapsid, wodurch entweder ein RcDNA-Genom oder doppelsträngige lineare DNA (DslDNA) Genom11,12Rückseite transkribiert. Diese Reife Nucleocapsids mit HBV-DNA-Genom sind schließlich umhüllt und als Virionen exportiert.

Infektion der Hepatozyten von umhüllten Teilchen mit DslDNA Moleküle führt zu viralen Integration in die Host Zelle Genom13, führt zu Replikation-inkompetent Formen der HBV-DNA-7,14,15. HBV-DNA-Integration tritt an der Stelle der chromosomalen doppelsträngige DNA Pausen15. Akkumulieren Beweis schlägt vor, dass jede Integration in einer im wesentlichen zufällige Position innerhalb der Host Zelle Genom16,17 Ereignisses. Darüber hinaus tritt HBV-DNA-Integration etwas selten, mit einer Rate von 1 pro 104 Zellen13,18,19,20. Wichtige Fragen bezüglich der HBV-DNA-Integration bleiben unbeantwortet, insbesondere im Hinblick auf die genaue molekulare Signalwege beteiligt, die Abhängigkeit von viralen und Host Faktoren, die virale Antigene von integrierten Formen und deren möglichen Beitrag ausgedrückt virale Persistenz-7. Wir haben ein in Vitro -Modell eingerichtet, einige dieser Fragen beleuchten.

Die Seltenheit der HBV-DNA Integrationsveranstaltungen (sowohl in Bezug auf Integration Preis pro Zelle und die Kopienzahl des jeweils einzigartige Integration) in in-vitro- HBV-Infektion Modelle machen sie schwierig um zu erkennen. Zelle Mitose ist in unserem in-vitro- System begrenzt, da teilende Zellen nicht effizient Infektion unterstützen. So, im Gegensatz zu in infiziert Patienten Leber Gewebe, wo bedeutende klonalen Expansion der Hepatozyten18,19,tritt,20, sehr wenige (1-2) Kopien jeder Integration in einem bestimmten Pool von Zellen vorhanden sind in-vitro- . Wir haben auch festgestellt, dass Integration vor allem bei der Erstinfektion der Hepatozyten (und nicht kontinuierlich in chronisch infizierte Hepatozyten)13 tritt. Dementsprechend kann nicht HBV-DNA-Integration durch Kultivierung einfach Zellen über einen längeren Zeitraum erhöht werden.

Im allgemeinen beflecken Methoden früher erkennen, integrierten HBV-DNA, einschließlich der südlichen Hybridisierung21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , Kassette-vermittelten Ligatur PCR28und ganze Genom Sequenzierung29,30,31,32,33, haben nicht die Sensibilität zu erkennen Single-Kopien von Integrationen. Wir und andere Forscher haben verwendet Inverse nested PCR (InvPCR) zur Erkennung von Hepadnaviral DNA-Integration in Ente, Murmeltier und infizierten menschlichen Lebern13,14,18,19, 34,35,36. Andere haben Verfahrensänderungen zur InvPCR-Technik eingeführt, die kann die Generierung der falsch-positiven Signale verändern und Einschränken der Fähigkeit zur Quantifizierung37. Wenn der Test durchgeführt wird, wie in diesem Protokoll beschrieben, stellt InvPCR einen spezifischen und sensitiv-Assay, der identifiziert und quantifiziert (in absoluten Heftnummern) mehrere HBV-DNA-Integrationen. Die HBV-Zelle DNA-Kreuzung ist mit einer einzigen Basenpaar-Auflösung ermöglicht publizierte Studien des viralen sequenziert und Host DNA-Sequenzen an den Standorten der Integration13.

Zuvor haben wir38 Ergebnisse aus InvPCR auf DNA von HBV-infizierten Gewebe extrahiert aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Leber Gewebe Snap eingefroren, Paraffin-eingebetteten Leber Abschnitte und extrem kleine Gewebeproben durch isoliert beschrieben. Laser-Mikrodissektion19. Dieses Protokoll enthält eine aktualisierte Version des einen InvPCR Test mit DNA extrahiert aus Zellgewebe Kultur abgeleitet nach in-vitro- Infektion, in denen niedrige Kopienzahl der Integrationen (1 – 2 Exemplare pro Integration) erzeugt werden. Die HBV-DNA-Integrationen gebildet in Vitro ähneln denen in Patienten Gewebe in Bezug auf ihre Verteilung gefunden über das zelluläre Genom und Kreuzung innerhalb der viralen Sequenz, die integrierte13,16, schlägt ein vergleichbaren Weg, um innerhalb einer infizierten Leber.

Protocol

(1) Zelle Infektion und DNA-Extraktion Pflegen Sie kultivierten Huh7-NTCP Zellen8,9 in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % V/V fötalen Rinderserum, 1 x Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt.Hinweis: Dies wurde zuvor im Detail40gemeldet. 2 x 105 Zellen/mL Huh7-NTCP Samenzellen in einer 12-Well-Platte mit 1 mL DMEM. Wenn Zelle Behandlungen (z. B. HBV-Hemmer) testen, wenden sie auf die Kultur überstand 4 h nach der Aussaat (1 Tag vor der HBV-Infektion). Beantragen Sie eine Negativkontrolle 200 nM Myrcludex B (ein potenter HBV Eintrag Inhibitor41). Verwenden Sie Heparin-Spalte gereinigt42 Überstand von HepAD3843 als ein Inokulum Zellen bei 1.000 VGE/Zelle in 500 µL Nährmedien (DMEM mit 10 % V/V fötalen Rinderserum, 1 x Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 2,5 % V/V ergänzt infizieren DMSO), mit 4 % w/V Polyethylenglykol 8000 [aufgelöst in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)]. Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator (bei 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit eingestellt). Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL sterilen 1 X PBS bei 16 – 24 h nach der Infektion. Ersetzen Sie die Kultur Medien alle 2 Tage nach HBV-Infektion bis zur Ernte. Am 3. Tag nach der Infektion, Behandlung von Zellen mit 5 µM Tenofovir Disoproxil und 10 µM Lamivudin, Produktion von HBV replikativen Zwischenprodukte zu begrenzen, die amplifiable von InvPCR sind. Am 5. Tag nach der Infektion trypsinize Zellen mit 200 µL Trypsin-EDTA und Aufschwemmen ihnen in 2 mL DMEM (ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 % V/V, 1 x Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), auch mit 5 µM Tenofovir Disoproxil und 10 µM Lamivudin. Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf eine 6-Well-Platte induzieren eine Runde der Mitose (die berichtet wurde, induzieren Verlust von HBV CccDNA44 und andere HBV-DNA-Zwischenprodukte, die amplifiable sind durch InvPCR). Am 7. Tag nach der Infektion trypsinize erweiterte Zellen in 400 µL Trypsin-EDTA und die Mischung in 1 mL DMEM aufzuwirbeln. Legen Sie die Suspension in einem 1,5 mL Röhrchen, pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min und den Überstand durch Absaugen entfernen. (Optional) Speichern Sie die Zelle Pellets bei-20 ° C, bis sie bereit sind für DNA-Extraktion. Extrahieren Sie die DNA aus der Zelle Pellet mit einem DNA-Extraktion-Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schätzen Sie die Endkonzentration DNA mit optischen Densitometrie.Hinweis: Die DNA-Ausbeute in einem 100 μL Elution Volumen ist in der Regel ~ 250-400 ng/μl. 2. Umkehrung der DNA Aliquoten ~1.5–2.5 μg von der Gesamt-DNA extrahieren aus Schritt 1 in ein 200 μL PCR-Röhrchen. Fügen Sie die entsprechende Menge an Restriktionsenzym Master-Mix zu einem 40 μl Reaktionsvolumen, enthält 1 x Digest Reaktion Puffer führen (zB., CutSmart Puffer) und 10 U Ncoich-HF. Die Reaktionen gründlich mischen und spin-down in ein Röhrchen-Zentrifuge. Inkubieren Sie die Einschränkung Enzymreaktion in einer PCR-Maschine bei 37 ° C für 1 h für eine optimale Verdauung Effizienz. Deaktivieren Sie das Restriktionsenzym durch Inkubation bei 80 ° C für 20 Minuten. Übertragen Sie die gesamte Restriktionsenzym Reaktion auf eine 1,5 mL-Tube. 400 μl 1 x T4 DNA-Ligase Puffer und 500 U T4 DNA-Ligase und mischen Sie es gründlich. Die großen Reaktionsvolumen fördert intramolekularer (im Gegensatz zu Inter molekulare) Ligatur der verdauten DNA-Fragmente. Inkubieren Sie die Ligatur Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h um vollständige Unterbindung zu gewährleisten. Die T4-DNA-Ligase bei 70 ° C für 20 min zu inaktivieren. Fügen Sie 10 μl 10 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat vollständige Inaktivierung von T4-Ligase sicherzustellen. Die Röhren durch Puls vortexen mischen und kurz spin-down der Reaktion-Mix. Eine Endkonzentration von 90 µg/mL NaCl, eine Endkonzentration von 100 mM und Dextran (35 – 45 kDa) hinzufügen. Die Röhren durch Puls vortexen mischen und kurz spin-down der Reaktion-Mix. Fügen Sie 900 μl aus 100 % Ethanol und Mix durch Umkehrung. Überstürzen Sie sich die DNA bei-20 ° C über Nacht. Pellet ausgefällte DNA durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 15 min. entfernen den Überstand durch Absaugen mit einer Pipette P200. Waschen Sie das Pellet mit 500 μL von 70 % V/V Ethanol und Zentrifugation bei 14.000 x g für 15 min. Entfernen Sie das Ethanol durch Absaugen mit einer Pipette P200. Trocknen Sie das DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 20 min an der Luft. Auflösen der Pellets in 20 μL der H2O. hinzufügen 20 μL Restriktionsenzym Master-Mix zu einem 40 μl Reaktionsvolumen mit 1 x Digest Reaktion Puffer, 5 U BsiHKAI und 5 U des Sph-HF Incubate führen die Beschränkung Enzymreaktion in einer Heizblock bei 37 ° C (die optimale Temperatur für Sph-HF) für 1 h. Kurz spin-down der Reaktion-Mix. Inkubieren Sie die Restriktionsenzym Reaktion in einem Hitze-Block bei 65 ° C (die optimale Temperatur für BsiHKAI) für 1 h. Kurz spin-down der Reaktion-Mix. Speichern Sie die invertierte DNA bei-20 ° C erst im nächsten Schritt. (3) verschachtelten PCR Entfernen Sie mögliche Amplifikate aus eine wiederverwendbare Mat Silikondichtung mit einem DNA-Abbau-Lösung, spülen Sie die Matte mit DNA-freies Wasser gründlich zu und an der Luft trocknen Sie es bei Raumtemperatur während der Vorbereitung der PCR Mischung. Bereiten Sie 1 mL einer 1 X PCR Mischung mit der äußeren Stürmer (5′-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3′) und rückwärts (5′-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3′) Primer bei einer Konzentration von 0,5 µM. Wells A1 und E1 in einer 96-Well-PCR-Platte 170 μL der 1 X PCR-Mischung hinzufügen. Wells B1 H1 120 μL der 1 X PCR-Mischung hinzufügen. Wells A1 und E1 10 μL der invertierten DNA aus Schritt 2 hinzufügen (2 verschiedene invertierte Proben können auf die gleiche PCR-Platte analysiert werden). Mix die Reaktion in jede Vertiefung von jeweils ca. 10 mal sanft Pipettieren verwenden ein P1000 voraussichtlich 100 μL. Seriell verdünnte Proben aus Brunnen A1 auf D1 bei einem Verhältnis von 1:3 durch die Übertragung von 60 μl bei jedem Schritt. Mischen Sie die Brunnen bei jedem Schritt durch pipettieren sie sanft über 10 Mal mit einem P1000 voraussichtlich 100 μL. Vermeiden Sie Luftblasen. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für gut E1 bis gut H1 verdünnen. Aliquoten 10 μL des Reaktionsgemisches mit einem Multi-Kanal-Pipette aus Brunnen A1-H1 in Vertiefungen A2-H2, A3-H3, und so weiter bis hin zu Brunnen A12-H12 von 96-Well-Platte. Decken Sie die PCR-Platte mit der trockenen Silikon-Matte aus Schritt 3.1, fest drücken. Die Platte in einer PCR-Maschine und führen Sie das folgende Programm: 10 min bei 95 ° C; 35 Zyklen von 15 s bei 95 ° C, 15 s bei 54 ° C und 3 min bei 72 ° C; 7 min bei 72 ° C; halten Sie dann die Platte bei Raumtemperatur. Die Stifte von einem 96-poligen Replikator, Red-Hot mit dem Bunsenbrenner erhitzen und dann für mindestens 5 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Füllen Sie die Brunnen einer zweiten PCR-Platte mit 10 μL des 1 X PCR-Mix (mit einem Gel Last-fähige Puffer) und das innere vorwärts (5′-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3′) und rückwärts (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′) bei 0,5 µM. Sorgfältig aus PCR-Platte für 96-Well-Platte aus der ersten Runde PCR die Silizium-Matte entfernen und Vermeidung von Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen. Verwenden Sie den gekühlten Replikator, um die PCR-Produkte von 96-Well-Platte aus Erstrunden-PCR auf neu regelmÄÑig 96-Well-Platte zu übertragen. Die verschachtelten PCR mit den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3,8, mit Ausnahme der Wechsel der ersten Denaturierung Schritts bei 95 ° C von 10 min, 2 min durchführen. (4) PCR Produkt Isolation und Gel Extraction Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese mit einer 96-Well mit 1,3 % w/V Agarose-Gel. Für eine 100 mL-Agarose-Gel bei 200 V für 10 – 15 min laufen. Verbrauchssteuern Sie die DNA-Bands aus der Agarose-Gele mit Einweg-Trinkhalme. Für jede PCR-Produkt das Stroh und Agarosegel stecken in einem 1,5 mL-Tube und das Stroh auf Größe mit einer Schere schneiden.Hinweis: Es ist ausreichend, um Bands nur aus diesen Verdünnungen zu isolieren, in dem einzelne PCR-Produkten gelöst werden können. (Optional) Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C für die spätere Extraktion. Werfen Sie die Agarose-Stecker in jede Röhre durch Zusammendrücken am Ende das Stroh Fragment. Jedes Rohr 300 μL der Gel Extraktionspuffer und 5 μL Gel Extraktion Glas Bead Gülle hinzufügen. Die PCR-Produkte gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Gel Extraction Kit (außer mit Hälfte-Bände für Waschschritte) zu extrahieren und die DNA aus den Perlen mit 30 μl Wasser eluieren. Legen Sie die gereinigte DNA für Sanger Sequenzierung (gemäß Anweisungen des Anbieters) mit dem Forward Primer verwendet, in der zweiten Runde nested PCR. 5. Sequenz-Analyse Bestätigen Sie Virus-Zell-DNA-Kreuzungen von Nukleotid BLAST Analyse (unter Verwendung der Standardeinstellungen ausrichten der gesamten Nukleotid-Auflistung).Hinweis: Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3 weiter unten beschrieben. Wenn nur teilweise Ausrichtung der Sequenz zu beobachten ist, schneiden Sie die 5′ HBV-DNA-Sequenz vor erneut eine Explosion Laufanalyse. Gelten Sie strenge Auswahlkriterien, um festzustellen, ob eine gegebene Folge eine echte Integration Kreuzung wie folgt darstellt: Enthalten nur Sequenzen mit > 20 bp einer zellulären Sequenz für zuversichtlich Mapping auf das zelluläre Genom. Ignorieren Sie alle Sequenzen, die Restriktionsschnittstellen Enzyme innerhalb 10 bp der vermeintlichen Virus-Zelle Integration Kreuzung, als sie wahrscheinlich repräsentieren in-vitro- Ligatur Ereignisse als echte Integration Kreuzungen enthalten. Alle Sequenzen mit offensichtlich unterschiedliche Fluoreszenz Pegelspitzen auf beiden Seiten der vermeintlichen Integration Kreuzung in Sequenzierung Chromatographen, zu ignorieren, da diese wahrscheinlich von Cross-Kontamination während der Sequenzierung Reaktion erzeugt Artefakte sind oder Kapillar Chromatographie. Definieren Sie einzigartige Integrationsveranstaltungen als diejenigen mit dem genauen HBV und zelluläre Sequenzen an der Kreuzung von Virus-Zelle.Hinweis: Wiederholung der einzigartigen Integrationsveranstaltungen führt von klonalen Expansion der Zellen, in denen diese Integrationen oder Cross-Kontamination während der PCR (die negativ-Kontrolle Reaktionen, in die repräsentativen Ergebnisse näher getestet werden können siehe unten). Wiederholte Integrationen in spezifischen zellulären Sequenzen sollen Standorten HBV terminal für jede Veranstaltung Integration anzeigen wie nicht-homologe Ende Beitritt Wege gebrauchte15 sind. Berechnen Sie die Integration Frequenz durch Multiplikation den Verdünnungsfaktor der invertierten DNA-Vorlagen durch die Anzahl der Virus-Zelle Kreuzungen bei dieser Verdünnung, gefolgt von Normalisierung in Höhe von insgesamt DNA Eingang in die Umkehrung Reaktion erkannt. In der Regel die Integration Frequenz liegt im Bereich von 01:104 LiPo-Zellen.

Representative Results

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der InvPCR-Technik. Ein Beispiel-Agarose-Gelelektrophorese von einer erfolgreichen InvPCR ist in Abbildung 2 dargestellt, vor und nach der PCR-Produkt-Isolierung. Abbildung 3 zeigt die Explosion Analyseausgabe aus Schritt 5.1 in den Fällen von (i) Verstärkung der Virus-Zell-DNA-Kreuzung und (Ii) Verstärkung der HBV-DNA-replikative Zwischenprodukt. Erwartete Ergebnisse von Positivkontrollen: Huh7-NTCP-Zellen mit Heparin-gereinigte HBV Bestände infiziert, wie beschrieben (Abbildung 1) können als Positivkontrolle dienen. In diesem Fall sollte die einzelnen PCR-Produkte durch die zweite oder dritte 1:3 verdünnen jeder Probe (entspricht ~ 104 Zelle-Äquivalente pro Verdünnung, Abbildung 2) erreicht werden. Bei diesen Verdünnungen wird etwa 50 % der Produkte echte Virus-Zelle DNA-Kreuzungen, vertreten, während die andere Hälfte steht für Verstärkung der HBV-DNA-Zwischenprodukte (Abbildung 3). In früheren Studien13fanden wir einige Instanzen der wiederholten Virus-Zelle Kreuzungen, schlägt keine zelluläre genomische Standorte der bevorzugte HBV-DNA-Integration. Wir finden auch, dass >80 % der Virus-Zelle Kreuzungen zwischen 1732 und 1832 (nach der Nukleotid Nummerierung der HBV-Genotyp D, GenBank Beitritt #U95551.1), Nukleotide auftreten, wobei Letzteres der rechten Endpunkt des HBV DslDNA Form darstellt. Sequenzen der echten Virus-Zelle Kreuzungen fand durch unsere Methode in in-vitro- Experimenten sind öffentlich zugänglich auf GenBank (Beitritt Zahlen MH057851 bis MH058006). Erwartete Ergebnisse aus Negativkontrollen: Huh7-NTCP-Zellen nicht infizierten oder geimpft Huh7-NTCP Zellen vorbehandelt mit Myrcludex B können als Negativkontrollen handeln. InvPCR Analyse der DNA extrahiert aus diesen Zellen sollten keine PCR-Produkte produzieren. Diese Negative Kontrollproben auf die gleiche PCR-Platte als positiven Proben laufen erlaubt die Prüfung von Cross-Kontamination während des nested-PCR-Prozess. Der strengste Test für Cross-Kontamination läuft eine Negative Kontrollprobe in Brunnen A-D und die positive Probe in Brunnen E-H auf einer 96-Well-Platte. In diesem Fall ist die konzentrierteste Verdünnung der positiven Probe hintereinander direkt angrenzend an die zuletzt konzentrierte Verdünnung der negativen Probe laufen. Amplifikationsprodukte in Negative Kontrollproben eingehalten, Institut der Maßnahmen vorgeschlagen, die in der Diskussion um Kreuzkontaminationen Ereignisse zu minimieren. Abbildung 1: Schematische Abbildung des InvPCR Prozesses, HBV-DNA-Integrationen zu erkennen. Nach HBV-Infektion, nur eine Minderheit der Huh7-NTCP-Zellen enthalten HBV DslDNA (rot) integriert in das Wirtsgenom Zelle (rot), dargestellt im oberen Bereich. Gesamt-DNA wird dann extrahiert aus den Zellen (Schritt 1), (Schritt 2) invertiert und verstärkt durch nested PCR (Schritt 3). Gezeigt werden die relativen Positionen der Restriktionsenzym Sites (Ncoich und BsiHKAI) in der ausgeschnittenen Virus-Zell-DNA-Kreuzung. Die Figur ist aus einer früheren Veröffentlichung13angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Agarose-gel-Elektrophorese und anschließende Gel Gewinnung von einer erfolgreichen InvPCR. “M” steht für DNA-Marker Leiter. Jede Zeile 12 stellt technische Wiederholungen bei einer einzigen Verdünnung auf die PCR-Platte. Zwei umgekehrte DNS-Proben können pro PCR Platte/Agarosegel ausgeführt werden. Die PCR-Produkte für jede Verdünnung sollte titrieren heraus in einem ~ 1:3-Verhältnis. Extraktion der Produkte aus den zwei zuletzt konzentrierten Verdünnungen wo einzelne Bänder leicht isoliert werden können ist in der Regel ausreichend, da HBV-DNA-Integration Rate von Endpunkt Titration bestimmt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: BLAST-Analyse von InvPCR Produkt Reihenfolgen. Wie lange Traktate der Sequenz von Sanger-Sequenzierung, die Quelle der generiert werden DNA-Sequenzen ist in der Regel eindeutig. Starke Ausrichtung auf HBV und zelluläre Genom wird in verschiedenen Bereichen der FASTA Sequenz Datei generiert von Sanger beobachtet Sequenzierung im oberen Bereich, was auf eine echte Virus-Zelle DNA-Kreuzung. Im unteren Bereich wird die Sequenz nur Fragmente des HBV-Genoms, was auf ein Produkt, erzeugt durch die Amplifikation der ein neu HBV-DNA-Genom ausgerichtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Vor der Durchführung des Protokolls, ist es wichtig zu beachten, dass diese InvPCR-Assay eine hochsensible Technik, in der Lage ist, einzelne Kopien der DNA Schablone verstärken. Daher ist die Begrenzung der Kontamination von PCR-Produkte von größter Bedeutung. Folgende allgemeine Strategien, PCR-Produktverschmutzung zu begrenzen. (i) physisch getrennte Bereiche für die verschiedenen Schritte der Methode zu etablieren. Jeder Bereich sollten separate Laborkittel, und Handschuhe sollten geändert werden, beim Wechsel zwischen diesen Bereichen. Wir haben diesen Bereichen unten in der Reihenfolge von den meisten, geringste Wahrscheinlichkeit verunreinigt werden aufgeführt: PCR Produkt Extraktion und Sequenzierung Reaktion Aufstellfläche (Post-PCR); PCR-Vorlage Addition und geflammt-poligen Transferzone (wir haben PCR Hauben mit einer dekontaminierende UV-Lampe mit guten Ergebnissen verwendet); DNA-Extraktion und Inversion Bereich (Pre-PCR); und einen “DNA-Vorlage-freien” Bereich ausschließlich für die Zubereitung von Lager und PCR-Lösungen. (Ii) werden bewusst der Luftströmung im Labor als potentielle Fahrer von Cross-Kontamination. Insbesondere Kreuzkontamination von PCR-Reaktionen während der geflammt Pin Transfer Schritt ist am wahrscheinlichsten auftreten, und wird zu ungenau Quantifizierung der Integration Frequenz führen. PCR-Hauben können verwendet werden, um diese Kreuz-Ströme zu begrenzen. Negativkontrolle Brunnen (z. B. Myrcludex B-behandelten Proben oder keine Vorlagensteuerelemente) in der PCR können auch verwendet werden, für Cross-Kontamination zu testen. (Iii) begrenzen potenziellen PCR Verunreinigungen auf Pipetten und Arbeitsflächen von regelmäßig mit einer DNA-Abbau-Lösung abwischen.

Das hier angegebene Protokoll angeordnet ist, um die Integration eines bekannten infektiöser HBV Klons generiert aus der HepAD38 Zelle Zeile42erkennen. Wenn das Inokulum verwendet eine andere HBV-DNA-Sequenz (z. B. aus Patientenserum) ist, sollte dann das HBV-Genom zuerst sequenziert werden, um Kompatibilität von PCR-Primer und Inversion Design zu bestätigen. In den bisher veröffentlichten Studien19haben wir 3 Sätze Zündkapseln benutzt, die konservierte HBV-DNA-Sequenzen flankieren die erwartete Website der HBV-DNA-Integration Kreuzungen zu binden. Anderen Primer-Sequenzen und Protokolle wurden daraufhin die genomische Sequenz HBV44,45,46,47,48 beschrieben und erfolgreich arbeiten können.

Darüber hinaus können verschiedene HBV-anfälligen Zellen (z. B. primären humanen Hepatozyten, differenzierte HepaRG HepG2-NTCP) verwendet werden; Allerdings haben wir festgestellt, dass Huh7-NTCP-Zellen das größte Signal-Rausch-Verhältnis, bieten wenn man die Anzahl der Viren-Zelle DNA-Kreuzungen, die verstärkt werden, im Vergleich zu der Mittelstufe Virus-DNA, die verstärkte13ist. Vor allem unheilbar differenzierte Zellen wie primären humanen Hepatozyten oder differenzierte HepaRG Mitose, wodurch ein hohes Maß an amplifiable HBV-DNA-replikative Zwischenprodukte bleiben innerhalb der Zellen nicht effizient unterziehen. Wir haben festgestellt, dass ca. 90 % der amplifizierten Sequenzen HBV-DNA Rearrangements (und nicht Integrationsveranstaltungen) unheilbar differenzierte Zellen im Vergleich zu 70 – 50 % Hepatom Zelle Linien13 repräsentieren. Diese Produkte sind in der Regel HBV-DNA-Genom mit großen Deletionen in der Oberfläche und Kern open reading Frames, oder sie können HBV quasi-Arten mit einer zusätzlichen NcoI vor der SphSeite, die ich vor Ort vertreten. Die Verstärkung dieser HBV-Arten (einschließlich ein schematisches Diagramm) beschrieben im detail vorher13.

Es gibt einige Nachteile dieser Methode. Aufgrund der mühsamen und mehrtägige dieses Protokolls ist InvPCR für Hochdurchsatz-Analyse einer großen Anzahl von Proben nicht geeignet. Darüber, wie es stützt sich auf Verdünnung Titration zu begrenzen, ist unsere Methode nicht sehr präzise Quantifizierung; Obwohl es leicht Protokollebene Änderungen in der Integration Frequenz messen sollte.

Darüber hinaus eignet sich unser Inversion-Protokoll nur um Integrationen, die zwischen der Region des HBV-Genoms, DR2 und DR1 zu erkennen, wie die Mehrheit der HBV-Integrationen innerhalb dieser Region49auftreten. NGS Analyse der HBV Patienten Gewebe hat gezeigt, dass eine große Minderheit (bis zu ca. 50 %) kann auch außerhalb dieser Region49auftreten. Neue InvPCR Designs sind theoretisch in der Lage, diese Webseiten Integration erkennen, obwohl sie nicht (nach unserem Kenntnisstand) wurden noch nicht durchgeführt. IG, wegen der notwendigen Beschränkungsenzymsites stromabwärts von der Virus-Zelle Kreuzung Sequenz für die Inversion Reaktion erforderlich, InvPCR erkennt nicht alle Integrationen, die innerhalb der DR2 und DR1 Regionen des HBV-Genoms (d. h., wir haben geschätzt, dass ca. 10 % der alle Integrationen nachweisbar anhand in Silico Simulationen13). Allerdings gehört zu einem fokussierten Stapel von Proben mit einer kleinen Anzahl von verschiedenen Behandlungen angewendet, InvPCR die einzige praktischen Methoden zur Erkennung von integrierten HBV-DNA mit einer einzigen Basenpaar Auflösung.

Wir stellen daher Anwendungen dieser Methode dient eine Schlüsselrolle bei der Suche nach viralen (über Mutationen des Inokulums HBV), Mobilfunk (durch KO oder Überexpression bestimmter zellulärer Gene oder durch Anwendung von verschiedenen Drogen) und Umwelt ( z. B. Exposition gegenüber oxidativem Stress) Faktoren, die HBV-DNA-Integration zu induzieren. Mit dieser Methode und neu entwickelte Systeme der HBV-Infektion ermöglichen wir beispiellose Kontrolle über diese Faktoren, so dass sie gut isoliert und besser charakterisiert werden können. Wir erwarten auch, dass dies zu einem wichtigen Verständnis der zellulären Folgen der HBV-DNA-Integration, so auch führt, welche Maße virale Antigene (z. B. HBx oder HBsAg50) zum Ausdruck, aus dem integrierten Formular gebracht werden, was dieser Ausdruck steuert, und unabhängig davon, ob HBV Integration deutlich die zellulären Phänotyp zu einem Pro-onkogenen Zustand ändert. Die Ergebnisse dieser zukünftigen Studien haben eine tief greifende Auswirkungen auf die therapeutische Strategien zur Behandlung von chronischen Hepatitis B und auf dem Grundverständnis des Virus selbst.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit erhalten Mittel aus dem Deutschen Zentrum für Infektion Forschung (DZIF), TTU Hepatitis Projekte 5.807 und 5.704, die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP-15), und das australische Zentrum für HIV und Hepatitis-Virologie-Forschung.

Wir sind verpflichtet, Professor William Mason für seine Rolle in der Entwicklung der Originalmethode InvPCR und um uns zu zeigen. Wir möchten danken DRS. Yi Ni und Florian A. Lempp für Reagenzien (Zell-Linien und HBV Inokulum). Wir anerkennen Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt und Dr. Katrin Schöneweis für technische Hilfe. Wir sind dankbar, Miriam Kleinig für Korrekturlesen und Professoren Nicholas Shackel und Ralf Bartenschlager für eine nachhaltige Betreuung.

Materials

Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35 -45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051
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Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).
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