JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Published: November 07, 2018
doi:
10.3791/58202
,
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University Hospital, 2Gastroenterology and Liver Research Laboratory,Ingham Institute, 3German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

يصف لنا هنا الجيل في المختبر للحمض النووي HBV عبر نظام عدوى بفيروس التهاب الكبد البائي والكشف عن درجة عالية من الحساسية للتكامل (1 – 2 نسخة) استخدام معكوس متداخلة PCR.

Abstract

فيروس التهاب الكبد B (HBV) هو مشتركة الممرضات المنقولة بالدم تسبب سرطان الكبد وتليف الكبد الناجمة عن العدوى المزمنة. الفيروس يتطابق عموما من خلال الحمض النووي ابيسومال متوسطة؛ ومع ذلك، إدماج شظايا من الحمض النووي HBV في جينوم مضيف وقد لوحظ، على الرغم من أن هذا النموذج ليس ضروريا للنسخ المتماثل الفيروسية. الهدف المحدد، وتوقيت، والآليات بالحمض النووي HBV الذي يحدث التكامل لم تظهر البيانات واضحة، ولكن مؤخرا أنه يحدث في وقت مبكر جداً بعد الإصابة. هنا، في المختبر توليد والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات موصوفة بالتفصيل. لدينا بروتوكول على وجه التحديد يستفيض نسخة واحدة من خلايا الفيروس الحمض النووي التكاملات ويسمح الكمي المطلق والقرار زوج واحد-قاعدة تسلسل مفرق. طبق هذا الأسلوب على مختلف أنواع الخلايا HBV-عرضه (بما في ذلك خلايا الكبد البشري الأساسي)، إلى مختلف HBV طفرات، وبالاقتران مع مختلف المخدرات التعرض. ونتوقع هذه التقنية أصبح مقايسة مفتاح تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الظاهرة ذات الصلة سريرياً.

Introduction

HBV هو فيروس الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي يمكن أن تسبب العدوى المزمنة مدى الحياة، مما يؤدي إلى تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية (HCC)1،،من23. وفي حين توجد عدة آليات الجزيئية القيادة HBV استمرار4 (مثلاً، ارتفاع ثبات القالب النسخي جينية فيروسية)، وتهرب مراقبة المناعية، وانخفاض معدل الدوران لخلايا الكبد في الكبد وما يرتبط بها مخاطر العقود بدء5،6 (مثل التهاب مزمن وتفعيل الخلوية التشديد على مسارات)، تم درس إدماج الحمض النووي HBV في جينوم الخلية المضيفة (إليه المبلغ عنها لكل من هذه الظواهر) ضعيف . سبب رئيسي هو عدم مناسبة في المختبر العدوى نظم HBV التي تتيح كشف يعول عليها لإحداث التكامل. هنا، نحن وصف بروتوكول وضعت مؤخرا لكل جيل في المختبر والكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات التي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة والآثار المترتبة عليها.

واستعرضت HBV النسخ المتماثل وتشكيل الحمض النووي HBV التكامل سابقا بالتفصيل7. بإيجاز، يدخل HBV خلايا الكبد باستخدام الصوديوم توروتشولاتي كوترانسبورتينج الببتيد (نتكب) مستقبلات الخلوية الرئيسية للعدوى8،9. نوكليوكابسيدس HBV المحتوية على استرخاء HBV التعميم الحمض النووي (ركدنا) يدخل الجينوم النواة، حيث ركدنا يتم تحويلها إلى الحمض النووي دائرية مغلقة تساهمي ابيسومال (كككدنا). كككدنا النووية بمثابة قالب النسخي مرناس الفيروسية وقبل المجينية الحمض النووي الريبي (بجرنا)10. ثم يتم حزم بوليميريز HBV وبجرنا في نوكليوكابسيدس المشكلة حديثا (التي تتألف من dimers البروتين الأساسية HBV). بجرنا HBV عكس نسخها داخل نوكليوكابسيد، مما أدى إلى أما جينوم ركدنا أو مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل خطي الحمض النووي (دسلدنا) جينوم11،12. وأخيراً هذه نوكليوكابسيدس الناضجة تحتوي على مورثات الحمض النووي HBV يلفها وتصديرها فيريونس.

يمكن أن تؤدي العدوى من خلايا الكبد بجسيمات المغلفة التي تحتوي على جزيئات دسلدنا الفيروسية إدماج المضيف الخلية الجينوم13، مما أدى إلى أشكال غير كفء النسخ المتماثل من الحمض النووي HBV7،،من1415. يحدث التكامل الحمض النووي HBV في موقع الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الصبغية فواصل15. تتراكم الأدلة تشير إلى أن يحدث كل حدث التكامل في وضع أساسا عشوائية داخل الخلية المضيفة الجينوم16،17. وبالإضافة إلى ذلك، يحدث التكامل الحمض النووي HBV نوعا ما إلا نادراً، بمعدل 1 من كل 104 خلايا13،18،،من1920. أسئلة هامة فيما يتعلق بإدماج الحمض النووي HBV لا تزال دون إجابة، لا سيما فيما يتعلق بالمسارات الجزيئية الدقيقة المعنية، الاعتماد على الفيروسية وعوامل المضيف، مولدات المضادات الفيروسية أعرب من النماذج المتكاملة، ومساهمتها المحتملة لاستمرار الفيروسية7. أنشأنا نموذجا في المختبر لتسليط الضوء على بعض هذه الأسئلة.

ندرة أحداث التكامل الحمض النووي HBV (سواء فيما يتعلق بمعدل إدماج كل خلية وعدد النسخ من كل تكامل فريد) في الإصابة في المختبر HBV نماذج جعل لهم تحديا للكشف. الانقسام الخلية محدودة في نظامنا في المختبر ، كما لا تدعم تقسيم الخلايا العدوى بكفاءة. وهكذا، خلافا في أنسجة الكبد المريض حيث يحدث توسع كبير الاستنساخ من خلايا الكبد1918،،20، جداً قليلة (1 إلى 2) نسخ من كل التكامل موجودة في مجمع معين من الخلايا المصابة في المختبر . وقد وجدنا أيضا أن التكامل يحدث أساسا أثناء الإصابة الأولى لخلايا الكبد (وليس بشكل مستمر في خلايا الكبد المصابين بأمراض مزمنة)13. تبعاً لذلك، لا يمكن زيادة التكامل الحمض النووي HBV ببساطة استزراع الخلايا لفترة أطول.

وبصفة عامة، الأساليب المستخدمة سابقا للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة، بما في ذلك جنوب لطخة التهجين21،،من2223،24،25، الو-بكر26،27 ، كاسيت بوساطة ربط PCR28، والجينوم كله التسلسل29،،من3031،،من3233، لم يكن لديك حساسية للكشف عن نسخ واحدة من التكامل. ونحن وغيرهم من الباحثين استخدموا معكوس متداخلة بكر (إينفبكر) للكشف عن تكامل الحمض النووي هيبادنافيرال في داك ووودكوك الاكباد المصابة البشرية13،14،،من1819، 35،،من 3436. أخرى أدخلت التعديلات الإجرائية إلى تقنية إينفبكر التي قد يغير توليد إشارات إيجابية كاذبة وتقييد القدرة على القياس الكمي37. إذا نفذ الفحص كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمثل إينفبكر مقايسة الخاصة والحساسة التي تحدد ويوضحها (بالأرقام المطلقة نسخة) متعددة الحمض النووي HBV التكاملات. يتم تعيين تسلسل الحمض النووي HBV-خلية التقاطع بدقة زوج قاعدة واحدة، السماح للدراسات بيوينفورماتيكال من الفيروسية وتسلسل الحمض النووي المضيفة في مواقع التكامل13.

التي وصفناها سابقا نتائج38 من إينفبكر في الأنسجة المصابة بالحمض النووي HBV المستخرجة من مجموعة كبيرة من المصادر، بما في ذلك أنسجة الكبد مجمدة في الأداة الإضافية وجزءاً لا يتجزأ من البارافين أقسام الكبد وعينات الأنسجة الصغيرة للغاية تم عزلة بواسطة الليزر-ميكروديسيكتيون19. ويحدد هذا البروتوكول إصدار محدث من الإنزيم إينفبكر استخدام الحمض النووي المستخرج من الخلية المستمدة من الثقافة الأنسجة بعد الإصابة في المختبر ، التي يتم إنشاؤها بإعداد نسخة منخفضة من التكاملات (1 – 2 نسخ كل التكامل). الحمض النووي HBV التكاملات شكلت في المختبر تشبه تلك الموجودة في أنسجة المريض فيما يتعلق بتوزيعها على الجينوم الخلوي وتقاطع داخل التسلسل الفيروسي هو متكامل13،16، مما يوحي الطريق قابلة للمقارنة إلى داخل كبد المصابين.

Protocol

1-الخلية العدوى واستخراج الحمض النووي الحفاظ على مثقف Huh7-نتكب الخلايا8،9 في المتوسطة (دميم “تعديل النسر” دولبيكو) وتستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين.ملاحظة: هذا قد سبق أبلغ في التفصيل40. البذور 2 × 105 خلايا/مل Huh7-نتكب الخلايا في صفيحة 12-جيدا مع 1 مل دميم. إذا كان اختبار علاجات الخلية (مثل مثبطات HBV)، تطبيقها لثقافة طاف ح 4 بعد البذر (يوم واحد قبل الإصابة HBV). تطبيق عنصر تحكم سلبية، 200 نانومتر ميركلوديكس ب (قوية HBV دخول المانع41). استخدام المادة طافية42 عمود الهيبارين تنقيته من HepAD3843 العدوى لتصيب خلايا في 1,000 فج/خلية في 500 ميليلتر للثقافة الإعلامية (دميم وتستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين و 2 مم الجلوتامين ل 2.5% v/v [دمس])، الذي يحتوي على 4% w/v البولي إثيلين غليكول 8000 [حله في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)]. ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية (تعيين في شركة 5%2 و 90% رطوبة). تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل PBS العقيمة 1 س في ح 16-24 بعد الإصابة. استبدال وسائط الثقافة كل يومين بعد الإصابة بالتهاب حتى الحصاد. في يوم 3 ما بعد الإصابة، علاج الخلايا مع ديسوبروكسيل التنفوفير مكم 5 و 10 ميكرون ولاميفودين للحد من إنتاج HBV وسيطة ريبليكاتيفي التي يتم أمبليفيابل من إينفبكر. في يوم 5 ما بعد الإصابة، تريبسينيزي الخلايا مع 200 ميليلتر يدتا التربسين وريسوسبيند لهم في 2 مل دميم (تستكمل مع 10% v/v الجنين المصل البقري، 1 x البنسلين/ستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين)، التي تتضمن أيضا ديسوبروكسيل التنفوفير مكم 5 و 10 ميكرومتر ولاميفودين. نقل تعليق خلية إلى لوحة 6-جيدا للحث على جولة واحدة من الانقسام (التي أبلغت للحث على فقدان HBV كككدنا44 وأخرى وسيطة الحمض النووي HBV التي أمبليفيابلي إينفبكر). في اليوم السابع بعد الإصابة، تريبسينيزي الخلايا الموسعة في 400 ميليلتر يدتا التربسين وريسوسبيند المخلوط في 1 مل دميم. ضع التعليق في أنبوب 1.5 مل وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز x 500 لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية بالطموح. (اختياري) تخزين الكريات الخلية في-20 درجة مئوية حتى أنهم على استعداد لاستخراج الحمض النووي. استخراج الحمض النووي من خلية بيليه باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تقدير تركيز الحمض النووي النهائي باستخدام قياس كثافة بصرية.ملاحظة: الحمض النووي العائد في وحدة تخزين شطف 100 ميكروليتر هو عموما ~ 250-400 نانوغرام/ميكروليتر. 2-انعكاس للحمض النووي استخراج ميكروغرام ~1.5–2.5 الكوة من الحمض النووي المجموع من الخطوة 1 في أنبوب بكر 200 ميكروليتر. إضافة المقدار المناسب من إنزيم التقييد الرئيسي-مزيج ليسفر عن رد فعل ميكروليتر 40 مجلد يتضمن 1 × خلاصة رد فعل المخزن المؤقت (مثلاً.، كوتسمارت المخزن المؤقت) و 10 يو ضابط صفمن أنا-التردد. مزيج ردود الفعل دقة وتدور إلى أسفل في الطرد أنبوب صغير. تبني رد فعل إنزيم التقييد في جهاز PCR عند 37 درجة مئوية لح 1 لكفاءة الهضم الأمثل. إلغاء تنشيط إنزيم التقييد التي تفرخ في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل رد فعل إنزيم التقييد الكامل لأنبوب 1.5 مل. إضافة ميكروليتر 400 1 x T4 الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت و 500 ش دنا T4 ليجاسى ومزجها جيدا. وتشجع حجم رد فعل كبيرة داخل الجزيئية (مقارنة بين الجزيئية) ربط أجزاء الحمض النووي هضمها. تبني رد فعل ربط في درجة حرارة الغرفة ح 2 لضمان ربط كاملة. إلغاء تنشيط ليجاسى T4 الحمض النووي عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إضافة 10 ميكروليتر من 10% w/v الصوديوم دوديسيل كبريتات ضمان المنظمة كاملة من ليجاسى T4. مزج الأنابيب بنبض فورتيكسينج وتدور بإيجاز ميكس رد فعل. إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي 100 مم وديكستران (35 – 45 كاتشين) بتركيز نهائي 90 ميكروغرام/مل. مزج الأنابيب بنبض فورتيكسينج وتدور بإيجاز ميكس رد فعل. إضافة 900 ميكروليتر من الإيثانول 100% ومزيج من انعكاس. يعجل في الحمض النووي في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بيليه الحمض النووي سرع بالطرد المركزي في 14,000 س ز على 15 دقيقة إزالة المادة طافية بتطلع مع ماصة P200. أغسل بيليه مع 500 ميكروليتر من 70% v/v الإيثانول والطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 15 دقيقة. إزالة الإيثانول بتطلع مع ماصة P200. أيردري بيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. حل بيليه في 20 ميكروليتر من ح2سين إضافة 20 ميكروليتر مزيج ماجستير إنزيم التقييد ليسفر عن رد فعل ميكروليتر 40 مجلد يتضمن 1 × خلاصة رد فعل المخزن المؤقت و 5 يو من مكتب التحقيقاتهكاي، و 5 يو من Sph-HF. إينكوباتي رد فعل إنزيم التقييد في كتلة الحرارة عند 37 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى سفأنا-HF) ح 1. باختصار تدور أسفل هذا المزيج رد فعل. تبني رد فعل إنزيم التقييد في كتلة حرارة عند 65 درجة مئوية (درجة الحرارة المثلى ل مكتب التحقيقاتهكاي) ح 1. باختصار تدور أسفل هذا المزيج رد فعل. تخزين الحمض النووي مقلوب في-20 درجة مئوية حتى الخطوة التالية. 3-يعشق [بكر] إزالة أمبليكونس المحتملة من ختم حصيرة سيليكون القابل لإعادة الاستخدام باستخدام حل تدهور الحمض النووي وشطف حصيرة جيدا بمياه خالية من الحمض النووي، وأيردري في درجة حرارة الغرفة أثناء تحضير الخليط PCR. إعداد 1 مل مزيج x PCR 1 التي تحتوي على الأمام الخارجي (5 ‘-عقاري بنا TCA CCT CTG CAC ز-3’)، وعكس (5 ‘-AAA GGA CGT CCC فريق المساعدة النقدية-3’) الإشعال في تركيز من 0.5 ميكرومتر. إضافة 170 ميكروليتر من مزيج x PCR 1 إلى الآبار A1 و E1 في صفيحة بكر 96-جيدا. إضافة ميكروليتر 120 من مزيج x PCR 1 إلى الآبار B1 إلى H1. إضافة 10 ميكروليتر من الحمض النووي المقلوب من الخطوة 2 إلى الآبار A1 و E1 (يمكن تحليل عينات معكوس مختلفة 2 على نفس اللوحة PCR). باستخدام مزيج من رد الفعل في كل بئر بلطف بيبيتينج كل منها حوالي 10 مرات P1000 تعيين إلى 100 ميكروليتر. الآبار عينات تمييع متسلسل من A1 إلى D1 بنسبة 1:3 بنقل ميكروليتر 60 في كل خطوة. مزيج من الآبار في كل خطوة من بيبيتينج لهم بلطف حول 10 مرات استخدام P1000 تعيين إلى 100 ميكروليتر. تجنب تشكيل الفقاعات. كرر الخطوة E1 جيدا، 3.6 إضعاف وصولاً إلى H1 جيدا. الكوة 10 ميكروليتر من خليط رد فعل استخدام ماصة متعدد القنوات من آبار A1-H1 في آبار A2-H2، H3-A3، وهلم جرا حتى وصلت إلى الآبار A12-H12 بليت 96-جيدا. تغطية لوحة بكر مع حصيرة السيليكون الجافة من الخطوة 3.1، ضغط بشدة. ضع اللوحة في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية؛ دورات 35 من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية، 15 s في 54 درجة مئوية و 3 دقيقة في 72 درجة مئوية؛ 7 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ بعد ذلك، اضغط اللوحة في درجة حرارة الغرفة. الحرارة دبابيس دبوس 96 وحدة النسخ المتماثل إلى ملتهب مع موقد بنسن وثم يبرد لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ملء الآبار من صفيحة بكر الثاني مع 10 ميكروليتر 1 ميكس x PCR (الذي يحتوي على مخزن مؤقت جل جاهزة لتحميل) وإعادة توجيه داخلية (5 ‘-كجك ATG هفوة لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق الإدارية دايمنشن A-3’) وعكس (5 ‘-CAC AGC كبار المستشارين التقنيين الائتلاف دول مجلس التعاون الخليجي ATG ز-3’) في 0.5 ميكرومتر. بعناية إزالة حصيرة السيليكون من لوحة PCR لصفيحة 96-جيدا من PCR الجولة الأولى، وتجنب التلوث المتبادل بين الآبار. استخدام تبريد وحدة النسخ المتماثل لنقل منتجات PCR لوحة 96-جيدا من PCR الجولة الأولى للوحة 96-بئر الكوتيد حديثا. إجراء PCR متداخلة باستخدام نفس الشروط كما هو الحال في الخطوة 3، 8، باستثناء تغيير الخطوة الأولى تمسخ عند 95 درجة مئوية من 10 دقيقة إلى 2 دقيقة. 4-بكر المنتج العزلة واستخراج هلام تحليل منتجات PCR بالتفريد جل استخدام 96-جيدا مع 1.3% w/v [اغروس] هلام. لجل [اغروس] 100 مل، تشغيل 200 الخامس لمدة 10 – 15 دقيقة. المكوس العصابات الحمض النووي من المواد الهلامية [اغروس] استخدام قش الشرب المتاح. لكل منتج PCR، ضع القش و [اغروس] هلام توصيل أنبوب 1.5 مل وتقليم سترو إلى حجم مع المقص.ملاحظة: أنها كافية لعزل العصابات فقط من تخفيف تلك التي يمكن حلها واحدة [بكر] منتوجات. (اختياري) تخزين الأنابيب في-20 درجة مئوية لاستخراج لاحقة. إخراج المقابس [اغروس] إلى كل أنبوب بواسطة الضغط على نهاية جزء القش. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لاستخراج جل و 5 ميكروليتر من جل استخراج الزجاج حبة الملاط لكل أنبوبة. استخراج منتجات PCR وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لأدوات استخراج هلام (باستثناء باستخدام وحدات التخزين نصف للغسيل الخطوات) والوت الحمض النووي من الخرز مع 30 ميكروليتر من المياه. يقدم الحمض النووي المنقي سانغر التسلسل (حسب تعليمات المورد) مع التمهيدي إلى الأمام المستخدمة في الجولة الثانية متداخلة PCR. 5-تسلسل التحليل تأكيد تقاطعات الحمض النووي الفيروس الخلية عن طريق إجراء تحليل انفجار النوكليوتيدات (باستخدام الإعدادات الافتراضية المحاذاة إلى جمع كامل النوكليوتيدات).ملاحظة: نتائج تمثيلية مفصلة في الشكل 3 أدناه. إلا إذا كان يلاحظ جزئية المحاذاة في التسلسل، تقليم 5 ‘ تسلسل الحمض النووي HBV قبل إعادة تشغيل إجراء تحليل لانفجار. تطبيق معايير انتقاء صارمة لتحديد إذا كان تسلسل معين يمثل مفترق طرق تكامل حقيقي كما يلي: تشمل فقط تسلسلات التي تحتوي على > 20 شركة بريتيش بتروليوم لتسلسل الخلوية لتعيين ثقة بالجينوم الخلوي. تجاهل أية تسلسلات التي تحتوي على مواقع تقييد أي الإنزيمات المستخدمة داخل 10 bp لملتقى التكامل خلية الفيروس المفترض، كما أنها تمثل احتمالاً في المختبر ربط الأحداث بدلاً من تقاطعات التكامل الحقيقي. تجاهل أي تسلسل مع مستويات fluorescence الذروة متباينة واضحة على جانبي ملتقى التكامل المفترض في تسلسل تشروماتوجرافس، أن هذه هي التحف المحتمل المتولدة عن التلوث عبر خلال تفاعل التسلسل أو الشعرية اللوني. تعريف أحداث تكامل فريد كتلك مع HBV الدقيقة وتسلسل الخلوية عند مفرق خلية الفيروس.ملاحظة: يمكن أن يؤدي تكرار أحداث تكامل فريد من الاستنساخ توسيع نطاق الخلايا التي تحتوي على هذه التكاملات أو التلوث عبر خلال بكر (الذي يمكن اختبار باستخدام ردود الفعل السلبية لمراقبة، بمزيد من التفصيل في نتائج تمثيلية أدناه). ومن المتوقع متكررة التكاملات في تسلسل الخلايا المحددة لعرض المواقع الطرفية HBV المختلفة لكل حدث التكامل، كما هي مسارات الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة تستخدم15. حساب تردد التكامل بضرب عامل تخفيف لقوالب الحمض النووي مقلوب عدد من تقاطعات خلية الفيروس اكتشفت في إضعاف ذلك، يليه تطبيع لمبلغ إجمالي الحمض النووي الإدخال إلى رد فعل انعكاس. عموما، تواتر التكامل بناء على أمر من 01:104 خلايا.

Representative Results

تمثيل تخطيطي لتقنية إينفبكر يرد في الشكل 1. ويرد مثال [اغروس] هلام التفريد من إينفبكر نجاح في الشكل 2 قبل وبعد عزلة منتج PCR. ويبين الشكل 3 تحليل الانفجار ناتج خطوة وسيطة replicative الحمض النووي HBV 5.1 في الحالات (ط) تضخيم مفرق الحمض النووي الفيروس الخلية والتضخيم (ثانيا). النتائج من الضوابط الإيجابية المتوقعة: Huh7-نتكب الخلايا المصابة مع الهيبارين تنقية مخزونات HBV كما هو موضح أعلاه (الشكل 1) يمكن أن تكون بمثابة عنصر إيجابي. في هذه الحالة، ينبغي تحقيق واحد بكر المنتجات بتمييع الثانية أو الثالثة 1:3 لكل عينة (يقابل ~ 104 مكافئات الخلية الواحدة وتمييع، الشكل 2). في تخفيف هذه، سيمثل حوالي 50% منتجات خلية الفيروس الحقيقي تقاطعات الحمض النووي، بينما يمثل النصف الآخر تضخيم الحمض النووي HBV وسيطة (الشكل 3). في الدراسات السابقة13، وجدنا حالات قليلة من تقاطعات خلية الفيروس المتكررة، مما يشير إلى لا مواقع المجينية الخلوية التفضيلية الحمض النووي HBV التكامل. ونجد أيضا أن >80% من تقاطعات خلية الفيروس تحدث بين النيوكليوتيدات 1732 و 1832 (وفقا النوكليوتيدات ترقيم HBV الوراثي د، “الانضمام إلى بنك الجينات” #U95551.1)، حيث تمثل هذه المحطة الأيسر من النموذج دسلدنا HBV. تسلسل تقاطعات خلية الفيروس الحقيقي وجدت من خلال أسلوبنا في تجارب في المختبر متاحة للجمهور في بنك الجينات (أرقام انضمام MH057851 إلى MH058006). النتائج من الضوابط السلبية المتوقعة: وقاية الخلايا Huh7-نتكب أو تلقيح Huh7-نتكب الخلايا قبل التعامل مع ب ميركلوديكس يمكن أن تعمل كعناصر سلبية. يجب أن تنتج إينفبكر تحليل الحمض النووي المستخرج من هذه الخلايا لا منتجات PCR. يسمح تشغيل هذه العينات السالبة لمراقبة على نفس اللوحة PCR كعينات إيجابية في اختبار للتلوث عبر أثناء عملية PCR متداخلة. هو الاختبار الأكثر صرامة للتلوث عبر تشغيل عينة سلبية-التحكم في الآبار أ-د وعينه إيجابية في الآبار ح ه على لوحة 96-جيدا. وفي هذه الحالة، يتم تشغيل إضعاف العينة الإيجابية الأكثر تركيزاً في صف المتاخمة مباشرة لإضعاف مركزة أقل من العينة سلبية. إذا كانت منتجات التضخيم لوحظت في عينات مراقبة سلبية، معهد التدابير المقترحة في المناقشة للتقليل من التلوث عبر الأحداث. رقم 1: الشكل التخطيطي لعملية إينفبكر للكشف عن الحمض النووي HBV التكاملات. بعد الإصابة بالتهاب، أقلية فقط من الخلايا Huh7-نتكب تتضمن HBV دسلدنا (أحمر) تدمج في جينوم الخلية المضيفة (أحمر)، يصور في القسم الأعلى. مجموع الحمض النووي هو ثم المستخرجة من الخلايا (الخطوة 1) مقلوب (الخطوة 2) ويضخم من يعشق [بكر] (الخطوة 3). يظهر هي المواضع النسبية للمواقع إنزيم التقييد (ضابط صفو مكتب التحقيقاتحقي) في تقاطع قصت الفيروس خلايا الحمض النووي. هذا الرقم مقتبس من منشور سابق13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: [اغروس] هلام التفريد واستخراج هلام اللاحقة نجاح إينفبكر. ويمثل “M” سلم علامة الحمض النووي. ويمثل كل صف من 12 replicates التقنية في إضعاف واحد على لوحة PCR. يمكن تشغيل اثنين من عينات الحمض النووي مقلوب كل بكر لوح/[اغروس] هلام. ينبغي أن تيتراتي منتجات PCR لتمييع كل أصل في ~ 1: نسبة 3. استخراج المنتجات من تخفيف مركزة على الأقل اثنين حيث العصابات واحدة يمكن أن تكون معزولة بسهولة يكفي بوجه عام، كما يتحدد معدل الاندماج الحمض النووي HBV نقطة نهاية المعايرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 3: تحليل الانفجار من تسلسل المنتج إينفبكر. كما يتم إنشاء مساحات طويلة من تسلسل من سانغر التسلسل، مصدرا لتسلسل الحمض النووي عموما لا لبس فيها. يلاحظ المحاذاة قوية HBV والجينوم الخلوي في مناطق مختلفة من ملف تسلسل FASTA التي تم إنشاؤها من سانغر التسلسل في أعلى اللوحة، مما يوحي بتقاطع دنا خلية فيروس حقيقي. في أسفل اللوحة، محاذاة التسلسل فقط إلى أجزاء الجينوم HBV، مما يشير إلى منتج المتولدة عن التضخيم الجينوم الحمض النووي HBV آخر أعيد ترتيبه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

قبل تنفيذ البروتوكول، من المهم أن نلاحظ أن هذا الإنزيم إينفبكر تقنية عالية حساسية، قادرة على تضخيم نسخة واحدة من قالب الحمض النووي. ولذلك، الحد من التلوث الناجم عن منتجات PCR ذات أهمية قصوى. فيما يلي الاستراتيجيات العامة للحد من تلوث المنتج PCR. (ط) إنشاء مناطق منفصلة فعلياً للخطوات المختلفة للأسلوب. ينبغي أن يكون لكل مجال المعاطف مختبر منفصلة، ويجب تغيير القفازات عند التنقل بين هذه المناطق. لدينا سرد هذه المجالات أدناه بالترتيب من معظم إلى الأقل احتمالاً تكون ملوثة: بكر الاستخراج وتتابع رد فعل إنشاء منطقة المنتج (وظيفة-PCR)؛ إضافة قالب بكر ودبوس ملتهب نقل المنطقة (وقد استخدمنا أغطية PCR مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية ديكونتاميناتينج مع نتائج جيدة)؛ منطقة الاستخراج وانعكاس الحمض النووي (ما قبل-PCR)؛ ومنطقة “الحمض النووي خال من قالب” تستخدم فقط لإعداد الأوراق المالية وحلول PCR. (ثانيا) أن يكون علم بتدفق الهواء في المختبر كسائق محتملة للتلوث عبر. على وجه الخصوص، التلوث عبر ردود الفعل بكر أثناء الخطوة نقل دبوس ملتهب الأكثر احتمالاً أن يحدث، وسوف يؤدي إلى التقدير الكمي غير دقيقة لوتيرة التكامل. يمكن استخدام أغطية PCR للحد من هذه التيارات العابرة. آبار المراقبة السلبية (مثلاً عينات تعامل ب ميركلوديكس أو أية عناصر تحكم قالب) في ال [بكر] يمكن استخدامها أيضا لاختبار للتلوث عبر. (ثالثا) الحد من الملوثات المحتملة بكر على الماصات وأسطح العمل بانتظام مسح أسفل مع حل تدهور الحمض النووي.

يتم ترتيب البروتوكول المحدد هنا للكشف عن تكامل استنساخ HBV المعدية المعروفة التي تم إنشاؤها من خط خلية HepAD3842. إذا كانت العدوى استخدام تسلسل الحمض النووي HBV مختلفة (مثلاً، من مصل المريض)، ثم الجينوم HBV ينبغي أن تكون أول متسلسلة لتأكيد التوافق [بكر] كبسولة تفجير وتصميم انعكاس. في19من الدراسات المنشورة سابقا، فقد استخدمنا 3 مجموعات من الإشعال التي تربط المصانة تسلسل الحمض النووي HBV المرافقة الموقع المتوقع للحمض النووي HBV تكامل الوصلات. تسلسلات التمهيدي والبروتوكولات الأخرى قد ورد وصف لتحديد تسلسل الجينوم HBV44،،من4546،،من4748 وقد تعمل بنجاح.

وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام خلايا HBV-عرضه مختلفة (مثلاً خلايا الكبد البشرية الأساسية، هيبرج المتباينة، HepG2-نتكب الخلايا)؛ ومع ذلك، وجدنا أن الخلايا Huh7-نتكب توفير أكبر نسبة الإشارة إلى الضجيج، عند النظر في عدد خلايا الفيروس الحمض النووي الوصلات التي تزداد مقارنة بفيروس الحمض النووي الوسيطة التي يتم تضخيم13. على وجه الخصوص، لا تخضع الخلايا المتمايزة لا شفاء منها مثل خلايا الكبد البشرية الأولية أو هيبرج المتباينة كفاءة الانقسام، أدى إلى ارتفاع مستوى الحمض النووي HBV أمبليفيابل وسيطة replicative المتبقية داخل الخلايا. وقد وجدنا أن ~ 90% تسلسلات تضخيم تمثيل الحمض النووي HBV ترتيبات جديدة (وعدم إدماج الأحداث) في الخلايا المتمايزة لا شفاء منها، مقارنة مع 70-50% في خطوط الخلايا الكبدي13. هذه المنتجات عموما جينوم الحمض النووي HBV المحتوية على الحذف الكبيرة في المياه السطحية والأساسية قراءة الإطارات المفتوحة، أو أنها يمكن أن تمثل الأنواع شبه HBV مع إضافية ضابط صفأنا الموقع قبل Sphأنا الموقع. التضخيم من هذه الأنواع HBV (بما في ذلك الرسم تخطيطي) قد وصفت بالتفصيل سابقا13.

وهناك عدة عيوب لهذا الأسلوب. نظراً لطبيعة شاقة ومتعددة اليوم من هذا البروتوكول، لا تتناسب مع إينفبكر إلى تحليلات الفائق لعدد كبير من العينات. وعلاوة على ذلك، كما أنها تعتمد على الحد من معايرة تمييع، أسلوبنا ليس درجة عالية من الدقة في التحديد الكمي؛ وعلى الرغم من أنه ينبغي قياس بسهولة تغيير مستوى سجل في وتيرة التكامل.

وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول انعكاس فقط مناسب للكشف عن التكاملات التي تقع بين منطقة DR2 و DR1 الجينوم HBV، كما تحدث غالبية HBV التكامل داخل هذه المنطقة49. خ ع تحليل HBV أنسجة المريض قد أظهرت أن أقلية كبيرة (تصل إلى ~ 50 ٪) قد تحدث أيضا خارج هذه المنطقة49. تصاميم إينفبكر جديدة نظرياً قادراً على الكشف عن هذه المواقع التكامل الأخرى، على الرغم من أنهم لا (على حد علمنا) قد نفذت حتى الآن. فائدتين، بسبب المواقع إنزيم التقييد اللازمة المطلوبة المصب من تسلسل الفيروس–خلية تقاطع لرد فعل انعكاس، إينفبكر لم يكشف جميع التكاملات التي تقع داخل مناطق الجينوم HBV DR2 و DR1 (أي، نحن ويقدر أن ~ 10% من جميع التكاملات قابلة للاكتشاف باستخدام المحاكاة في السيليكون 13). ومع ذلك، عند تطبيق مجموعة مركزة من العينات مع عدد قليل من العلاجات المختلفة، إينفبكر واحدة من طرق العملي الوحيد للكشف عن الحمض النووي HBV المتكاملة في قرار واحد لزوج قاعدي.

ونحن نتصور ذلك تطبيقات هذا الأسلوب يخدم دوراً رئيسيا في إيجاد الفيروسية (عن طريق طفرات العدوى HBV)، الخلوي (عن طريق خروج المغلوب أو overexpression من الجينات الخلوية محددة، أو من خلال تطبيق مختلف العقاقير)، والبيئة ( مثلاً، التعرض للأكسدة) العوامل التي تحفز الحمض النووي HBV التكامل. مع هذا الأسلوب ونظم العدوى HBV المطورة حديثا، ونحن تمكين التحكم لم يسبق لها مثيل لهذه العوامل حتى يمكن أن تكون معزولة جيدا واتسمت أفضل. ونتوقع أيضا أن هذا سيؤدي إلى فهم رئيسية لعواقب الخلوية للحمض النووي HBV التكامل، بما في ذلك ما مدى المضادات الفيروسية (مثلاً، HBx أو HBsAg50) يتم التعبير عنها من خلال نموذج متكامل، ما هي الضوابط هذا التعبير، وأم لا يتغير HBV التكامل إلى حد كبير النمط الظاهري الخلوية تجاه دولة برو-النمطان أكثر. نتائج هذه الدراسات في المستقبل سيكون لها أثر عميق على الاستراتيجيات العلاجية المستخدمة لعلاج التهاب الكبد المزمن وعلى الفهم الأساسي للفيروس نفسه.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل وتلقى تمويل من “المركز الألماني” للبحوث العدوى (دزيف) ووحدة تعقب المعاملات التهاب الكبد مشاريع 5.807 5.704، TRR179 الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) (ن 15)، و “المركز الأسترالي” لبحوث علم الفيروسات التهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية.

نحن مدينون للبروفسور وليام ماسون من جانبه في تطوير طريقة إينفبكر الأصلية، ومما يدل على أنه بالنسبة لنا. نود أن نشكر الدكتور يي ني وفلوريان ألف ليمب على الكواشف (خطوط الخلايا والعدوى HBV). نحن نسلم Rippert إنجا، [فرنزيسكا Schlund، انجيلهاردت سارة، والدكتورة كاترين Schöneweis للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون ميريام كلينيج لتصحيح التجارب المطبعية، والأساتذة نيكولاس شاكيل ورالف بارتينشلاجير للدعم المستمر.

Materials

Dulbecco’s PBS PAA H15-002
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 41965
Fetal bovine serum PAA A15-151 Heat-inactivate before use
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× PAA P11-010
L-glutamine, 200mM PAA M11-004
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× PAA L11-004
PEG, MW 8000 Sigma-Aldrich 89510 Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy Merck 102950
Tenofovir disoproxil Sigma-Aldrich CDS021622 Dissolve in DMSO
Lamivudine Sigma-Aldrich L1295 Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit Macherey Nagel 740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
NcoI-HF NEB R3193L
T4 DNA ligase NEB M0202T
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 433209
Dextran (35 -45 kDa) Sigma-Aldrich D1662-10G
Absolute Ethanol Sigma-Aldrich 32205-1L-D
BsiHKAI NEB R0570L
SphI-HF NEB R3182L
Amplitaq Gold Taq kit Thermo Fisher Scientific 4331816 Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates Biorad 2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution Thermo Fisher Scientific AM9890
96-well PCR plates Sigma Aldrich CLS6509 SIGMA
96-pin replicator Thermo Fisher Scientific 250520
GoTaq Flexi PCR kit Promega M8295 Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose Biozym 840004
QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN 20051
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, X., et al. Chronic hepatitis B virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  2. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  3. Huang, Y. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643-3650 (2011).
  4. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut. 64 (12), 1972-1984 (2015).
  5. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Jilbert, A. R. Conceptual models for the initiation of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Liver International. 35 (7), 1786-1800 (2015).
  6. Tu, T., Buhler, S., Bartenschlager, R. Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biological Chemistry. 398 (8), 817-837 (2017).
  7. Tu, T., Budzinska, M. A., Shackel, N. A., Urban, S. HBV DNA Integration: Molecular Mechanisms and Clinical Implications. Viruses. 9 (4), (2017).
  8. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, e00049 (2012).
  9. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  10. Tuttleman, J. S., Pourcel, C., Summers, J. Formation of the pool of covalently closed circular viral DNA in hepadnavirus-infected cells. Cell. 47 (3), 451-460 (1986).
  11. Staprans, S., Loeb, D. D., Ganem, D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. Journal of Virology. 65 (3), 1255-1262 (1991).
  12. Wang, G. H., Seeger, C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. Cell. 71 (4), 663-670 (1992).
  13. Tu, T., Budzinska, M. A., Vondran, F. W. R., Shackel, N. A., Urban, S. Hepatitis B virus DNA integration occurs early in the viral life cycle in an in vitro infection model via NTCP-dependent uptake of enveloped virus particles. Journal of Virology. , (2018).
  14. Yang, W., Summers, J. Integration of hepadnavirus DNA in infected liver: evidence for a linear precursor. Journal of Virology. 73 (12), 9710-9717 (1999).
  15. Bill, C. A., Summers, J. Genomic DNA double-strand breaks are targets for hepadnaviral DNA integration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11135-11140 (2004).
  16. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Sequence Analysis of Integrated Hepatitis B Virus DNA during HBeAg-Seroconversion. Emerging Microbes and Infections. , (2018).
  17. Budzinska, M., Shackel, N. A., Urban, S., Tu, T. Cellular genomic sites of HBV DNA integration. Genes. , (2018).
  18. Mason, W. S., Liu, C., Aldrich, C. E., Litwin, S., Yeh, M. M. Clonal expansion of normal-appearing human hepatocytes during chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 84 (16), 8308-8315 (2010).
  19. Tu, T., et al. Clonal expansion of hepatocytes with a selective advantage occurs during all stages of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 22 (9), 737-753 (2015).
  20. Mason, W. S., et al. HBV DNA Integration and Clonal Hepatocyte Expansion in Chronic Hepatitis B Patients Considered Immune Tolerant. Gastroenterology. 151 (5), 986-998 (2016).
  21. Shafritz, D. A., Shouval, D., Sherman, H. I., Hadziyannis, S. J., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into the genome of liver cells in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Studies in percutaneous liver biopsies and post-mortem tissue specimens. New England Journal of Medicine. 305 (18), 1067-1073 (1981).
  22. Hino, O., et al. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinomas in Japan. Hepatology. 4 (1), 90-95 (1984).
  23. Fowler, M. J., et al. Integration of HBV-DNA may not be a prerequisite for the maintenance of the state of malignant transformation. An analysis of 110 liver biopsies. Journal of Hepatology. 2 (2), 218-229 (1986).
  24. Chen, J. Y., Harrison, T. J., Lee, C. S., Chen, D. S., Zuckerman, A. J. Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocellular carcinoma: analysis by hybridization with subgenomic DNA fragments. Hepatology. 8 (3), 518-523 (1988).
  25. Esumi, M., Tanaka, Y., Tozuka, S., Shikata, T. Clonal state of human hepatocellular carcinoma and non-tumorous hepatocytes. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 23 Suppl, S1-S3 (1989).
  26. Murakami, Y., et al. Large scaled analysis of hepatitis B virus (HBV) DNA integration in HBV related hepatocellular carcinomas. Gut. 54 (8), 1162-1168 (2005).
  27. Kimbi, G. C., Kramvis, A., Kew, M. C. Integration of hepatitis B virus DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B. World Journal of Gastroenterology. 11 (41), 6416-6421 (2005).
  28. Tamori, A., et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA. Clinical Cancer Research. 11 (16), 5821-5826 (2005).
  29. Sung, W. K., et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma. Nature Genetics. 44 (7), 765-769 (2012).
  30. Fujimoto, A., et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nature Genetics. 44 (7), 760-764 (2012).
  31. Jiang, S., et al. Re-evaluation of the Carcinogenic Significance of Hepatitis B Virus Integration in Hepatocarcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 7 (9), e40363 (2012).
  32. Jiang, Z., et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients. Genome Research. 22 (4), 593-601 (2012).
  33. Kan, Z., et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Research. 23 (9), 1422-1433 (2013).
  34. Summers, J., et al. Hepatocyte turnover during resolution of a transient hepadnaviral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (20), 11652-11659 (2003).
  35. Mason, W. S., Jilbert, A. R., Summers, J. Clonal expansion of hepatocytes during chronic woodchuck hepatitis virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (4), 1139-1144 (2005).
  36. Mason, W. S., et al. Detection of clonally expanded hepatocytes in chimpanzees with chronic hepatitis B virus infection. Journal of Virology. 83 (17), 8396-8408 (2009).
  37. Chauhan, R., Churchill, N. D., Mulrooney-Cousins, P. M., Michalak, T. I. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma. Oncogenesis. 6 (4), e317 (2017).
  38. Tu, T., Jilbert, A. R. Detection of Hepatocyte Clones Containing Integrated Hepatitis B Virus DNA Using Inverse Nested PCR. Methods in Molecular Biology. 1540, 97-118 (2017).
  39. Ni, Y., Urban, S. Hepatitis B Virus Infection of HepaRG Cells, HepaRG-hNTCP Cells, and Primary Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 15-25 (2017).
  40. Schulze, A., Schieck, A., Ni, Y., Mier, W., Urban, S. Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction. Journal of Virology. 84 (4), 1989-2000 (2010).
  41. Lempp, F. A., et al. Evidence that hepatitis B virus replication in mouse cells is limited by the lack of a host cell dependency factor. Journal of Hepatology. 64 (3), 556-564 (2016).
  42. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  43. Allweiss, L., et al. Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo. Gut. , (2017).
  44. Yang, Z. T., et al. Characterization of Full-Length Genomes of Hepatitis B Virus Quasispecies in Sera of Patients at Different Phases of Infection. Journal of Clinical Microbiology. 53 (7), 2203-2214 (2015).
  45. Chook, J. B., et al. Universal Primers for Detection and Sequencing of Hepatitis B Virus Genomes across Genotypes A to G. Journal of Clinical Microbiology. 53 (6), 1831-1835 (2015).
  46. Li, F., et al. Whole genome characterization of hepatitis B virus quasispecies with massively parallel pyrosequencing. Clinical Microbiology and Infection. 21 (3), 280-287 (2015).
  47. Zhou, T. C., et al. Evolution of full-length genomes of HBV quasispecies in sera of patients with a coexistence of HBsAg and anti-HBs antibodies. Scientific Reports. 7 (1), 661 (2017).
  48. Long, Q. X., Hu, J. L., Huang, A. L. Deep Sequencing of the Hepatitis B Virus Genome: Analysis of Multiple Samples by Implementation of the Illumina Platform. Methods in Molecular Biology. 1540, 211-218 (2017).
  49. Li, X., et al. The function of targeted host genes determines the oncogenicity of HBV integration in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 60 (5), 975-984 (2014).
  50. Wooddell, C. I., et al. RNAi-based treatment of chronically infected patients and chimpanzees reveals that integrated hepatitis B virus DNA is a source of HBsAg. Science Translational Medicine. 9 (409), (2017).

Tags

HBV DNA IntegrationHBV VirologyLow Copy NumberIn Vitro HBV InfectionInverse PCRCell CultureVirus IntegrationDNA ExtractionDNA DigestionQuantitative Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tu, T., Urban, S. Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection. J. Vis. Exp. (141), e58202, doi:10.3791/58202 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image