チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

上記の手順に従って散発的な家族性大腸腺腫症患者におけるAPC遺伝子の体細胞モザイクを見直しました。以前の研究では、 APC c.834 + 2 t > 両親、サンガーを使用してではなく、患者で、C 変異が発見されたシーケンスと NGS9。プライマーおよびプローブの代表の結果で使用されているデザインは表 3のとおりです。ゲノム DNA は、発端者、両親と六つの健康なドナーの血液から抽出されました。6.7 – 7.9 (図 2および表 4) 〜 9 gDNA サンプルの DIN の値。ファムと 16 進数として使用された蛍光染料 C と T の対立遺伝子のそれぞれ。位置のプロットに緑と黄色の斑点、それぞれファム ポジティブに、HEX ポジティブ パーティションを表します (図 3A)。ブルー スポットは、FAM と 16 進数の両方の否定的なパーティションを表します。黒の背景は、反応混合物が追加されましたいないパーティションに対応します。発端者の父親または NTC で C の対立遺伝子のいくつかの肯定的なパーティションが検出された、対立遺伝子が検出されなかった T の後者、肯定的なパーティションで C と T の対立遺伝子の多くの肯定的なパーティションが、発端者で検出されました。C と T の対立遺伝子間の信号分離は二次元 (2 D) 散布図を明確され、六角、FAM の最も肯定的な信号が互いに (図 3B) に排他的。発端者のエンは 13.2%、NGS (12.7%) を使用して決定するに似ています。(表 4)。発端者の両親の健康なドナー VAFs < 0.1% であった。APC c.834 + 2 t の検出限界 > C 変異は合計 gDNA10の 10-11 ng で繰り返し測定の標準偏差 × 3 を使用して 0.3% と推定されました。 APC c.834 + 2 t dPCR のアッセイで増幅サイズ > 123 に予測された C bp。DPCR 製品は、シングル バンドとして増幅されたことを確認するには、dPCR 製品は assayed チップから収集されました。電気泳動を使用して、単一のバンドが検出されたはっきりと製品サイズ (図 4) 予測と一致していた。 図 1: チップでチューブの形式で dPCR の試金のための注意点。(A) このパネルがオートローダ内 8 チューブ ストリップを設定する方法を示します。(B) このパネルには、壊れたチップが表示されます。(C) このパネルは、(i) 直後の読み込みおよび (ii) シールのチップの表面を示しています。(iii) 液体の水たまりが不完全なシールの場合表示されます。(D) このパネルは、交差汚染の場合位置のプロットを示しています。(E) このパネルは、不均一な分布の場合位置のプロットを示しています。水に浸漬管表面に気泡をこのパネル (F) を示していますどのように。(G) このパネルは、チューブ内の空気の泡を示しています。全体図で黒と白の矢印は壊れたチップ部分を示し、気泡、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 血 gDNA の代表エレクトロフェロ。騒音値が 6.7 と 7.9 血 gDNA のエレクトロフェロはそれぞれ上部と下部のパネルに表示されます。アスタリスクは、低いマーカーを示します。DIN: DNA の整合性の数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: DPCR を用いたチップ内管形式APC体細胞モザイクの代表の結果。(A) の位置をプロットし、発端者、父なしテンプレート コントロール (NTC) の (B) の散布図を示します。16 進数と FAM 参照とバリアントの遺伝子にそれぞれ対応します。縦線および横線はそれぞれ六角 FAM の輝度しきい値を示します。この図は、Kahyoらから変更されています。10.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: Assayed のチップから dPCR 製品のコレクションです。収集され、集中された dPCR 製品は、電気泳動を受けるでした。予測対象のサイズは 123 bp。この図は、Kahyoらから変更されています。10. NTC: いいえテンプレート コントロール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 試薬 濃度原液の ボリューム (μ L) 最終濃度 お勧めします最終濃度 DNase、RNase フリー蒸留水 – 1.75 – – PCR マスター ミックス × 2 – 7.5 – – 主要な対立遺伝子の LNA プローブ 2 Μ M 0.5 66.7 nM 3.33-100 nM マイナーな対立遺伝子の LNA プローブ 2 Μ M 0.5 66.7 nM 3.33-100 nM 前方のプライマー 1 Μ M 0.5 33.3 nM 3.33-50.0 nM 逆プライマー 1 Μ M 0.5 33.3 nM 3.33-50.0 nM dPCR ソリューション x 20 – 0.75 – – gDNA 3.33 ng/μ l 3 666 pg/μ l pg は 20 pg/μ L-2,000/μ L1 表 1: dPCR アッセイ用試薬。1予想の精度と感度によって異なります。 ステップ 温度 時間 サイクル 初期変性します。 95 ° C 3 + 1 変化させなさい。アニーリングをおよび拡張 95 ° C58 ° C 50 s90 s 42 最終的な拡張 70 ° C 3 + 1 表 2: サーマルサイクラー条件。 名 シーケンス1 Tm値2 前方のプライマー 5′-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ‘ 60.8 ° C 逆プライマー 5’-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ‘ 59.8 ° C T の対立遺伝子の LNA プローブ 5′-六角-ATTT [CCTGACCA IBFQ 3′ 一致: 62.6 ° C不一致: 45.3 ° C C の対立遺伝子の LNA プローブ 5′-ファム-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3’ 61.7 ° C の一致:不一致: 50.5 ° C テーブル 3: プライマーとプローブのデザイン。1下線付きと括弧で囲まれた文字は、それぞれ LNA とターゲット バリアントです。2プロトコルの手順 2 に従って計算されます。 NGS3 dPCR4 サンプル1 組織 DNA (ng) の入力 DIN2 エン (%) バリアント (コピー) 参照 (コピー) エン (%) 意味 RSD NTC – – – – 1.23 0 N/A N/A 発端者 血 11.3 7.6 12.7 379 2.48 x 103 13.2 0.0353 父 血 10.3 7.7 0.0167 1.08 3.42 × 103 0.0341 0.439 母 血 10.8 7.6 0.0136 0.956 3.04 × 103 0.0313 0.637 ドナー 1 血 11.7 7.3 – 1.64 3.01 × 103 0.0543 0.414 ドナー 2 血 10.5 7.6 – 1.06 2.90 × 103 0.0406 0.539 ドナー 3 血 17.6 7.9 – 4.24 5.65 x 103 0.0713 0.783 ドナー 4 血 12.3 7.6 – 2.38 4.16 × 103 0.0666 0.557 ドナー 5 血 19.2 7 – 1.48 6.79 x 103 0.0213 0.571 ドナー-6 血 14.4 6.7 – 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729 表 4: 結果、dPCR のアッセイのAPC体細胞モザイク。1NTC: いいえテンプレート コントロール;ドナー: 健康なドナー。2DIN: DNA の整合性の数。3岩泉ら9、ハム ゲノムと 2 15057 (2015 年)。4帳票と独立して繰り返し 3 x で実行された実験データは、平均値として表されます。RSD: 相対標準偏差;該当なし: 適用されません。テーブルは、Kahyoらから変更されています。10。