פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

תכנון המחקר אושרה על ידי לוחות סקירה המוסדי של המלונות בהם צפיתי מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה (G-260-4). בכתב הסכמה מדעת היה המתקבלים החולה והוריו. 1. בקרת איכות של דנ א גנומי הערה: הדנ א (gDNA) היה שחולצו מן הדם ההיקפיים בשיטת ומבוססת סיליקה-ממברנה מבוססי DNA טיהור. Advance של להלן נהלים, הריכוז של gDNA נקבע באמצעות ספקטרופוטומטרים. הכינו את הדגימה gDNA-ריכוז של 10 – 100 ng/µL. להוסיף 10 µL מאגר דגימת ה-DNA רצועת 8-שפופרת. להוסיף 1 µL של סולם הדנ א או gDNA הצינורות. מערבולת התערובת במשך 1 דקה באמצעות הקובץ המצורף microplate. טען את הצינור, ג’ל התקן פיפטה טיפים לתוך כלי אלקטרופורזה (טבלה של חומרים) ולהתחיל לרוץ על-ידי לחיצה על כפתור “התחל”.הערה: מערכת אלקטרופורזה יפעל באופן אוטומטי בלחיצה אחת על לחצן התחל. לאשר כי בסמן התחתון הכלולים במאגר דגימת DNA מוקצה כראוי על electropherograms. אם זה מוקצה באופן שגוי, להקצות באופן ידני את סמןמצב Electroherogram”של התוכנה.הערה: המספר שלמות הדנ א (דין) באופן אוטומטי מחושבים. הערך דין מגיע שלמות הדנ א. גבוה ונמוך ערכי דין מציינים gDNA ומתפקד מפורק חריפה מאוד, בהתאמה. ציין את האזור בגודל gDNA (> 200 bp) ב- ‘מצב האזור’ של התוכנה כדי לחשב באופן אוטומטי את ריכוז gDNA (> 200 bp). 2. פריימר ועיצוב בדיקה לחשב את ערכי טמפרטורה (Tm) ההיתוך באמצעות כל כלי גישה פתוחה בתנאים הבאים: 10 – 25 בסיסים, 50 מ מ נה+/K+, dNTPs מ”מ 0.80 ו- 3 מ מ ג2 + (טבלה של חומרים). לעצב את תחל ואחורה כדי להגביר את האזור גנומית המכיל אללים היעד עם הערךm T בסביבות 60 ° C, אורך אמפליקון ב bp 100 – 300.הערה: עיין טבלה 1 לקבלת הריכוז של oligonucleotides. עיצוב חומצות גרעין נעול (מגבר קדם) רגשים עבור אללים הפניה וגרסא מבוסס על התנאים הבאים: (i) 1 – 6 LNAs נמצאים כל בדיקה; (ii) הפלורסנט ו כ’חטיף נוכחים-5′- ו 3′-terminuses של כל בדיקה, בהתאמה; (iii) ההבדל בין ערכיm T הגששים מתאימים, שאינם תואמים הוא > 10 ° C; (iv) ערכיm T של הגששים תואמים, לא תואמת הם גבוהות ונמוכות יותר מאלה של תחל בהתאמה [למשל, פריימר לפנים: 60.8 ° C, פריימר הפוכה: 59.8 ° C, הפניה אלל בדיקה (מתאימים/תואמים): 62.6/45.3 ° C, משתנה בדיקה אלל (מתאימים/תואמים): 61.7/50.5 ° C]. ערכיm T חושבו באמצעות הכלי גישה פתוחה לשימוש גם עבור שלב 2.1. ודא כי תחל מעוצב של הגששים לא להקיף את פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד עם תדירות של > 0.1% כפי שנקבע ממסדי [למשל, מסד הנתונים פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (dbSNP)]. 3. PCR דיגיטלי להכין את צבעי בסיס, הגששים ופתרונות gDNA מניות בריכוזים המתוארות בטבלה 1 עם מאגר טה ואחסן אותם ב-20 – 4 ° C. מערבבים את ריאגנטים בטמפרטורת החדר הנפח הכולל של µL 15 כדי ריכוז הסופי כפי שמתואר בטבלה 1. להוסיף 3 µL של מים מזוקקים במקום gDNA פקד לא-תבנית (NTC). להכין 3.5 x כמות התערובת PCR שהפקידים להביא בחשבון השגיאה pipetting. Pipette את התערובת PCR מעלה ומטה כדי לערבב את הכל. הגדר פלטפורמת העמסה על גבי האסימונים נבנה ברצועת 8-שפופרת ולהעלות אותם על טוען סרטים אוטומטי. ודא כי קיים קשר בין השבב לרציף הטעינה. מתאים מחוון טעינה על פלטפורמת והחזק את המחוון עם בלם רד במטען. פיפטה µL 15 של תערובת PCR על הרציף ליד הקצה של המחוון (איור 1א’). הפעל את טוען על ידי לחיצה על הלחצן של מטעין (עבור-1 דקות).הערה: זו לא בעיה אם כמות קטנה של תערובת PCR נשאר על הרציף. זה אפשרי ברצף הפעלה מחדש בטען. הגדר את הצ’יפ-ב–הצינור ממולא תערובת PCR בתוך החריץ בצד של משפר איטום. לדחוף את המכסה שקופית לבין הקצה של המכסה העליון לא לשבור השבב (איור 1B). הפעל את שיפור האטימה (כ- 2 דקות). ברצף הפעל מחדש את מגבר איטום 1 דקות אם שלולית נוזל עדיין גלוי בגלל איטום לא שלם גורם של זיהום צולב של האותות חיובי (דמויות 1C וד’ 1). הוסף µL 230 של איטום נוזל, מגיב על בסיס שמן, את הצינורות.הערה: האסימונים צריכים עכשיו להיות שקוע בתוך הנוזל. להגדיר את הצינורות הצנטרפוגה תרמי. הפעל הצנטרפוגה תרמי כמפורט בטבלה מס ‘ 2 (עבור 2h). לכוון את הטמפרטורה או משך ה-PCR אם יש הפצה אחידה של מחיצות חיובי (איור 1E).הערה: מומלץ לקבוע את קצב הרמפה סביב 1 ° C/s. השאירו את הצינורות הצנטרפוגה תרמי למשך לפחות 15 דקות כדי להפחית את הרעש בסיסית.הערה: הצינורות ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה גם כן. קרינה פלואורסצנטית אותות אותרו אפילו למחרת. להגדיר את הצינורות על החגיגה זיהוי ויוצקים 6 מ של מים מזוקקים לתוך החגיגה. אם בועות אוויר גלויים האחורה הצינורות, לנקות אותם (דמויות 1F ו 1 G). טען לנענע הגלאי ולהפעיל אותו באמצעות לחיצה על לחצן ‘הפעל’ של התוכנה לאחר בחירת כרטיסיות Fluorescene, ניסוי, דוגמת/NTC (טבלה של חומרים).הערה: זיהוי צבע כפול שמונה דגימות בעוצמה ברירת המחדל לוקח כ 4-5 דקות. לאשר את מיקום מגרש, היסטוגרמה עלילה פיזור 2D.הערה: iIf עוצמת קרינה פלואורסצנטית המחיצות שלילי גבוה, להתאים את עוצמת בלחיצה על הלחצן ‘ קביעות ‘ של התוכנה כך שהוא נופל בטווח של 30-70. לחשב את השבר אלל variant (VAF) באמצעות הנוסחה הבאה:Cv ו- Cr הנה העתק המספרים של variant, אלל הפניה, בהתאמה.הערה: הם מחושבים באופן אוטומטי בתוכנית תוכנה המבוססת על סטטיסטיקה פואסון. 4. אוסף של מוצר ה-PCR הסר נוזל איטום באמצעות הרכבת התחתית. להוסיף 100 µL טה מאגר ברכבת התחתית. מערבולת נמרצות במשך 30 s ו בקצרה צנטריפוגה הצינור. להעביר את הפתרון טה צינור אחר ולהוסיף µL 30 של 3 מ’ סודיום אצטט µL 200 של אתנול. מגניב הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Centrifuge הפתרון למשך 30 דקות ב 16,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע. להוסיף 300 µL של 80% כוהל שפופרת ואת מערבולת. Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב 16,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע. לאפשר את התמיסה על מילה נהדרת עבור 5 דקות. להמיס את התמיסה ב- 1-5 µL טה מאגר לאחר air-drying. במידת הצורך, להעריך את גודל המוצר באמצעות מכשיר אלקטרופורזה ביחס שלב 1. לטעון µL 1 של הפתרון למכשיר ג’ל רגישות גבוהה (טבלה של חומרים).