Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş
Summary
Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.
Abstract
RNA polimeraz II transkripsiyon genel kusurları kararlı durum RNA analiz transcriptomic çalışmaları tarafından göz ardı edilebilir. Nitekim, mRNA sentezi genel azalma mRNA bozulması normal kararlı durum düzeyleri geri yüklemek için eşzamanlı bir düşüş telafi edilebilir olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, genom çapında miktar mRNA sentezi mRNA decay, dan bağımsız olarak en iyi doğrudan RNA polimeraz II transkripsiyon etkinlik yansımasıdır. Burada, Sigara perturbing metabolik Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) içinde yeni doğmakta olan RNA’ların etiketlerine göre kullanarak bir yöntem tartışmak. Özellikle, hücreleri urasil analog, 4 thiouracil ile 6 dk kültürlü ve etiketli yeni transkripsiyonu RNA’ların saflaştırılmış ve tüm bireysel mRNA sentezi oranları belirlemek için sayılabilir. Ayrıca, kullanarak etiketli Schizosaccharomyces pombe hücreleri dahili standart farklı S. cerevisiae mRNA sentezi verir gibi suşları. Bu iletişim kuralını kullanan ve dinamik bir kinetik modeli ile veri uydurma, karşılık gelen mRNA decay oranları tespit edilebilir.
Introduction
Hücreleri endojen ve eksojen cues, dinamik değişiklik kendi gen ifade programı aracılığıyla yanıt. Son yıllarda, farklı koşullarda transcriptome değişiklikleri kesin ve kapsamlı açıklaması genom çapında metodolojileri muazzam bir gelişme sağlar. Çoğu transcriptomic çalışmalarda Mikroarray hibridizasyon veya yüksek üretilen iş sıralama toplam kararlı durum RNA kesir düzeylerinden RNA ölçmek için kullanılır. Transkripsiyon değişiklikleri belirli bir pertürbasyon altında belirli bir gen ifade değişikliklerle veya up – veya downregulated genler geniş bir yelpazede olası sonuçları geniş bir görüntüleyebilirsiniz. Gen ifadesinin ince ayarlı bir denge sonucudur — veya kararlı durum — tarafından RNA polimerazlar RNA sentezi ve RNA düzeyleri etkileyen diğer işlemler arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon, onun üç farklı aşamada (başlatma, uzama ve sonlandırma) dahil olmak üzere mRNA işleme, sitoplazmik ihracat, çeviri ve bozulma ile son derece ve girift ilişkilidir.
Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda mRNA sentezi ve çürüme eşleşmiş mekanizmalarının olduğunu gösterdi ve transkripsiyon etkileri mutasyon üzerine veya bir çekim gücü altında toplam kararlı durum RNA miktarının ne zaman göz ardı edilebilir olduğunu gösterdi. Birincisi, her zaman kararlı durum düzeyleri mRNA analizleri transkripsiyon değişimler tespiti mRNA’ların half-life üzerinde bağlıdır. Bir kez pertürbasyon tanıttı, mRNA’ların uzun yarı-ömrü olan kararlı durum düzeyleri daha az bu kısa yarı-ömrü olan mRNA’ların daha etkilenecektir. Bu nedenle, RNA sentezi değişiklikleri tespit şiddetle longer-lived mRNA türler analizini transkripsiyon hızı dinamik değişiklikler ortaya çıkarmak başarısız olabilir iken kısa ömürlü transkript lehine önyargılı olduğunu. İkinci olarak, çeşitli raporlar ve hem de Maya memeliler, transkripsiyon küresel değişimler mRNA kararlı durum düzeyde analiz ederken göz ardı, göstermiştir. Bu mRNA sentezi ve yıkımı mRNA tampon kaynaklanan bağlantı mekanizmaları nedeniyle muhtemeldir. Bu bozulma, yeni kopya etmek mRNA analizi ile gelen edilişi mRNA sentezi ölçmek için yeni protokoller geliştirme istenir. Son yıllarda, birkaç alternatif, küresel çalıştırma sıralama (GRO-seq)1ve sıralama (NET-seq)2,3yerli uzama transkript de dahil olmak üzere sunulmuştur. Burada, başlangıçta memeli hücreleri4,5,6 ‘ geliştirilen ve Maya7,8,9,10‘ auyarlanmış bir protokol bulunuyorlar, bir thiolated nükleozit veya temel analog ile etiketleme RNA dayanır, 11, 4-thiouridine (4sU) veya 4-thiouracil (4tU), anılan sıraya göre.
Bu yöntem özellikle yeni transkripsiyonu RNA hangi RNA hücrelerden arındırır darbe etiketli hücre homeostazı hemen hemen hiçbir girişim ile 4sU ile vardır. Sonra hücreleri 4sU için sunulan, bu nedenle, hızla 4sU-trifosfat için fosforile ve transkripsiyonu RNA’ların içinde dahil uptaken, moleküldür. Bir kez darbe etiketli, toplam Hücresel RNA (RNA kararlı durum düzeylere karşılık gelen) ayıklamak mümkündür ve daha sonra 4sU etiketli RNA kesir thiol-özellikle bu değişiklik, bir disülfür bağ oluşumu için biotin arasında önde gelen ve Yeni transkripsiyonu RNA4,5. Ancak, 4sU sadece insan equilibrative nükleozit ışınlama (hENT1), tomurcuklanma veya fisyon mayası hemen onun kullanımını engelleme gibi bir nükleozit taşıyıcı ifade hücreleri tarafından uptaken olabilir. Bir hENT1 S. pombe veya S. cerevisiaeifade olabilir iken, daha kolay bir yaklaşım, Maya hücreleri 4tU, ifade bir nükleozit ışınlama10, , gerek kalmadan kadar sürebilir bu yana değiştirilen temel 4tU kullanılarak elde edilebilir 11 , 12 , 13. Aslında, 4tU metabolizma enzim urasil phosphoribosyltransferase (UPRT) faaliyet gerektirir. Maya ama değil memeliler, dahil olmak üzere çeşitli organizmalarda UPRT urasil Üridin monofosfattır için geri dönüşüm pirimidin kurtarma yolu için esastır.
Transcriptomic çalışmalarda önemli bir önyargı paralel olarak analiz farklı örnekleri arasında normalleştirme tarafından tanıttı olabilir. Gerçekten de, birçok temaslara faktör transcriptome mutant ve vahşi-türü suşları karşılaştırmalı analizi etkileyebilir: hücre lizis, verimliliğini farklılıkları ayıklama ve RNA ve Mikroarray analizleri için tarayıcı kalibrasyon’deki kurtarma , diğerleri arasında. RNA polimeraz II transkripsiyon küresel etkileri beklenen yukarıda da açıklandığı gibi bu tür varyasyonları özellikle yanıltıcı olabilir. Doğru bir şekilde farklı örnekleri arasında mRNA sentezi oranlarını karşılaştırmak için zarif bir ortalama bir iç standart olarak uzaktan ilgili fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe kullanarak tasarlanmıştır. Bunun için sabit sayıda S. pombe etiketli hücreleri S. cerevisiae örnekleri, hücre lizis ve RNA ayıklama10önce vahşi-türü ya mutasyona uğramış hücreler eklenir. Daha sonra S. pombe ve S. cerevisiae kararlı durum hem yeni sentezlenmiş RNA’ların RT-qPCR veya üzerinden Mikroarray fiş ya da yüksek üretilen iş sıralama10kullanımı sayısal. Bu veriler kinetik modelleme ile birleştirerek, mRNA sentezi ve mayası çürümesi mutlak oranda ölçülebilir.
Bu makale çerçevesinde, biz nasıl RNA polimeraz II transkripsiyon tomurcuklanma coactivator kompleksleri destan ve TFIID14,15Maya için küresel bir rol ortaya çıkarmak için yeni transkripsiyonu RNA Analizi izin gösterir, 16. Önemlisi, son çalışmalar kararlı durum mRNA düzeyleri S. cerevisiae sayılabilir ve destan destan mutasyonlar kuvvetle etkilenen ama nispeten TFIID karşı olan Maya genler, sınırlı sayıda üzerinde baskın bir işlev çalış önerdi mutasyonlar17,18,19. Şaşırtıcı, destan enzimatik faaliyetleri tüm kopya etmek soykırım, RNA polimeraz II transkripsiyon Co bu harekete geçirmek için daha geniş bir rol öne hareket gösterilmiştir. Azalan RNA polimeraz II işe alım en ifade genler, destan veya TFIID, bu coactivators birlikte çoğu genleri çalışır düşündüren inactivation üzerine gözlendi. Bu nedenle, yeni kopya etmek mRNA miktar destan ve TFIID için neredeyse tüm genlerin transkripsiyonu RNA polimeraz II14,15,16tarafından gerekli olduğunu ortaya koydu. Telafi edici mekanizmaların uygulanması için hücreleri mRNA sentezi mRNA yıkımı eşzamanlı bir küresel düşüş arabelleğe alınmış genel bir azalma ile başa çıkmak bir yol olarak ortaya çıkıyor. DESTAN transkripsiyon faktörü TFIIH21,22 RNA polimeraz II transkripsiyon, RNA Pol II alt birimleri10gibi küresel bir etkisi, arabulucu coactivator karmaşık20, general sahip faktörler listesine ekler ve dolaylı olarak, öğeleri mRNA yıkımı makine9,10,23. Telafi tür olayların evrensel destan mutantlar, mRNA sentezi14küresel ve ciddi bir düşüş rağmen kararlı durum mRNA düzeylerinde mütevazı ve sınırlı değişiklikler için muhasebe gözlendi. Benzer analizler de tam bir kaybı histon H2B ubiquitination ile sonuçlanan bir BRE1 silme yük içinde gerçekleştirilmiştir. İlginçtir, bir çok daha hafif ama tutarlı küresel etkisi RNA polimeraz II transkripsiyon Maya içinde yeni transkripsiyonu RNA’ın metabolik etiketleme algılayabilir ve çok çeşitli mRNA değişiklikleri ölçmek olduğunu belirten Bre1, yokluğunda tespit edilemedi sentez oranları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transkripsiyon değişiklikleri analiz etmek için genom çapında araçları hala gelişiyordu iken, RNA’ın kararlı durum düzeyleri miktar üzerinden transcriptome tek analizini doğru değişiklikleri RNA polimeraz II etkinliğinde yansıtmıyor. Nitekim, mRNA düzeyleri sadece RNA sentezi tarafından aynı zamanda kendi olgunlaşma ve yıkımı tarafından düzenlenmektedir. MRNA yıkımı edilişi mRNA sentezi ölçmek için farklı protokolleri Maya ve memeliler doğmakta olan transkripsiyon analizi için son yı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onun desteği için Laszlo Tora ve V. Fisher, K. Schumacher ve F. El Saafin kendi tartışmalar için teşekkür ederiz. Tüberküloz Marie Curie-ITN Bursu (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) tarafından desteklenen ve Fondation ark. Bu eser fonlarından Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda ANR-10-LABX-0030-INRT, Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d’Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 altında tarafından yönetilen bir Fransız Devlet fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
References
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
- Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
- Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
- Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
- Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
- Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
- Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
- Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
- Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
- Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
- Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
- Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
- Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
- Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
- Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
- Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
- Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
- Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
- Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
- Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
- Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
- Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
- Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
- Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
- Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
- Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
