Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности

Клетки реагируют на эндогенных и экзогенных подсказки, через динамические изменения их программы выражения гена. В последние годы огромное развитие генома общесистемной методологии позволяет точное и всеобъемлющее описание транскриптом изменения в различных условиях. В большинстве исследований транскриптомики microarray гибридизации или высок объём последовательности используются для количественного определения уровня РНК от общей доли РНК установившегося. Transcriptional изменений под конкретные возмущения может отображать широкий спектр возможных результатов, с большой спектр генов вверх – или downregulated или изменения выражения определенного гена. Экспрессия генов является результатом точного равновесия — или стационарном — между синтез РНК, РНК-полимеразы и других процессов, влияющих на уровень РНК. Транскрипции РНК-полимераза II, включая его три этапа (инициации, элонгации и прекращение), высоко и неразрывно связан с обработки, цитоплазматических экспорта, перевод и деградации мРНК.

Несколько недавних исследований показали, что синтез мРНК и распада спаренных механизмы и показал, что транскрипционный анализ эффектов после мутации или под стимулы могут быть пропущены при количественной оценки общего устойчивого состояния РНК. Во-первых обнаружение transcriptional изменений путем анализа установившегося уровни mRNA всегда зависит от mRNAs half-life. Как только вводится возмущений, устойчивого состояния уровня мРНК с долгий период полураспада чем те мРНК с короткие периоды полураспада затронет гораздо меньше. Таким образом обнаружения изменений в синтез РНК является сильно предвзятым в пользу недолго стенограммы, в то время как анализ видов повериям мРНК могут не выявить динамических изменений курса транскрипции. Во-вторых несколько докладов показали, что, как в дрожжей и млекопитающих, могут игнорировать глобальные изменения в транскрипции, при анализе установившегося уровни mRNA. Это, вероятно, за счет механизмов, которые связывают синтез мРНК и деградации, что приводит к буферизации мРНК. Это побудило разработки новых протоколов для количественного определения синтез мРНК, расцеплено от деградации, путем анализа вновь трансляции мРНК. В последние годы были представлены несколько вариантов, включая глобальные выбега последовательности (GRO-seq)¹и родной удлинение Стенограмма виртуализации (NET-seq)^2,3. Здесь мы представляем протокол изначально разработанный в mammalian клетках^4,5,6 и затем адаптирована к дрожжи^{7,8,9,10, 11}, которая основана на РНК, маркировки с thiolated нуклеозидов или базовый аналоговый, 4-thiouridine (4СУ) или 4-thiouracil (4tU), соответственно.

Этот метод специально очищает недавно транскрипции РНК из клеток, в которых РНК, пульс помечены 4СУ практически без вмешательства в гомеостаза клетки. Таким образом после того, как клетки подвергаются 4СУ, молекула является быстро освоен, фосфорилированных 4СУ трифосфата и включены в РНК транскрипции. После того, как пульс меткой, это можно извлечь всего клеточной РНК (соответствующий уровень установившегося РНК), и, впоследствии, фракция 4СУ меченых РНК тиоловых специально изменены, приводит к образованию дисульфидных связей между биотина и Недавно транскрипции РНК^4,5. Однако 4СУ только может быть освоен, выражая нуклеозидный транспортер, как человека equilibrative нуклеозидный транспортер (hENT1), предотвращая ее немедленного использования бутонизации или деления дрожжевой клетки. Хотя одно может выразить hENT1 S. pombe или S. cerevisiae, более простой подход может быть достигнуто с помощью измененный базовый 4tU, так как клетки дрожжей может занять до 4tU, без необходимости выражения нуклеозидный транспортер^{10, 11 , 12 , 13}. В самом деле, метаболизм 4tU требует активности фермента урацила phosphoribosyltransferase (UPRT). В нескольких организмов, в том числе дрожжи, но не млекопитающих UPRT имеет важное значение для пути спасения пиримидина, переработка урацила в уридина монофосфат.

Важное значение смещения в транскриптомики исследования могут быть введены по нормализации отношений между различными образцы, проанализированы параллельно. Действительно, многие иные факторы могут повлиять на сравнительный анализ транскриптом мутант и дикого штаммов: эффективность лизис клеток, различия в добыче и восстановления РНК, и разницы в калибровка сканера для microarray анализ , среди других. Как говорилось выше, такие различия может быть особенно заблуждение, когда глобальные последствия для транскрипции РНК полимеразой II, как ожидается. Элегантный значит точно сравнить ставки синтез мРНК между различными образцами был разработан с использованием дрожжей отдаленно связанные деления Делящиеся дрожжи как внутренний стандарт. Для этого, фиксированное количество помечены S. pombe ячеек добавляется образцы S. cerevisiae , одичал тип или мутант клетки, до лизис клеток и РНК добыча¹⁰. Впоследствии как статических, так и заново синтезированные РНК от S. pombe и S. cerevisiae количественно RT-ПЦР или через использование высокопроизводительного секвенирования¹⁰или обломоки microarray. Сочетание этих данных с кинетического моделирования, абсолютное ставки мРНК синтеза и распада в многообещающий дрожжей могут быть измерены.

В рамках этой рукописи мы покажем, как анализ недавно транскрипции РНК позволил выявить глобальную роль для комплексов coactivator Сага и TFIID в транскрипции РНК полимеразой II в многообещающий дрожжей^{,14,15 16}. Важно отметить, что последние исследования количественно уровни mRNA установившегося в S. cerevisiae и предложил, что сага играет функцию преобладающим на ограниченный набор генов дрожжей, которые сильно пострадавших от мутации в Сага, но относительно устойчив к TFIID мутации^17,18,19. Удивительно Сага ферментативную деятельность были продемонстрированы действовать в целом транскрипции генома, предлагая более широкую роль для этого совместного активатор транскрипции РНК полимеразой II. Снижение РНК полимеразой II найма на наиболее выраженное генов было отмечено по инактивации Сага или TFIID, предполагая, что эти коактиваторы работать вместе на большинство генов. Следовательно количественная оценка недавно трансляции мРНК показали, что Сага и TFIID необходимы для транскрипции почти всех генов РНК полимеразы II^14,,1516. Осуществление компенсационных механизмов возникает как способ для клетки, чтобы справиться с глобальным снижением синтеза мРНК, который буферизуется одновременное снижение глобальной деградации мРНК. Сага добавляет в список факторов, имеющих глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II, например, РНК Pol II подразделения¹⁰, посредник coactivator комплекс²⁰, Генеральный транскрипционным фактором TFIIH^21,22 и косвенно, элементы^10,9,механизм деградации мРНК²³. В Сага мутантов, приходится скромные и ограниченные изменения в стационарном уровни mRNA несмотря на глобальных и серьезным снижением синтеза мРНК¹⁴универсально наблюдались такие компенсационные мероприятия. Были также подобные анализы в BRE1 исключить деформации, что приводит к полной потере гистона H2B ubiquitination. Интересно, что гораздо мягче, но последовательно глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II могут быть обнаружены в отсутствие Bre1, указав, что метаболические маркировки недавно транскрипции РНК в дрожжи можно обнаружить и количественно оценить широкий спектр изменений в мРНК синтез ставки.