Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Альтернативного сплайсинга (AS)-это общий процесс, который происходит во время созревания пре мРНК. В этом процессе экзона дифференциально могут быть включены в зрелой мРНК. Таким образом через AS, один ген может генерировать много мРНК код для различных белковых продуктов. Предполагается, что 92 – 94% генов человека проходят альтернативного сплайсинга^1,2. Аномальные альтернативного сплайсинга шаблоны в результате генетических мутаций были связаны с большое количество заболеваний, в том числе боковой амиотрофический склероз, Миотоническая Дистрофия и рак^3,4. Таким образом, важно изучить и лучше понять альтернативного сплайсинга механизмов регулирования в попытке найти новые методы лечения заболеваний человека.

КАК часто регулируются на основе конкретного типа ячейки. Важно определить шаблон AS выражения определенного гена в данной биологической системе. Однако это становится сложным, когда сложный орган, который содержит много различных типов клеток, таких как мозг или сердце, изучается. В этом случае идеальный выбор системы анализа является РНК в situ гибридизация (ISH) с использованием ткани разделы, так как выражения определенного гена могут быть обнаружены во многих типах клеток одновременно. Действительно конкретных Эксон зонды были использованы для оценки уровня выражения альтернативных экзона^5,6,7. Однако этот подход не является хорошо подходит для, как анализ по следующим причинам. Во-первых, обычные методы иш обычно используют датчики, больше чем 300 bp, в то время как средний размер позвоночных внутреннего экзонов (не первый или последний экзона) составляет 170 нуклеотидов^8,9. Во-вторых когда конкретных Эксон зонда используется для изучения сплайсинга шаблон внутренней альтернативных экзона, только изоформы мРНК, обнаруженных зонд является тот, который содержит экзона, в то время как мРНК изоформы без экзона не могут быть обнаружены. Таким образом расчет процентов, сращивания (PSI) значение для альтернативных экзона является сложным. Кроме того обычные флуоресцентные иш часто сочетаются иш иммуноокрашивания, что снижает эффективность обнаружения и надежность. Например, в исследовании, которая расследовала стресс индуцированного сплайсинга изоформы переключение ацетилхолинэстеразы (АВО) мРНК, digoxigenin была включена в ISH зонд и обнаружить с помощью антител анти digoxigenin. Кроме того биотин меченых зонд был обнаружен конъюгата щелочной фосфатазы/стрептавидина и субстрата для¹⁰щелочной фосфатазы. Чтобы увеличить чувствительность обнаружения ни метод использует любой стратегии усиления. В результате это сложно обнаружить стенограммы мРНК, которые выражаются на низком уровне. Таким образом проще и более надежна иш пробирного система необходима для анализа как выражение шаблонов в situ.

BaseScope недавно была разработана на основе платформы RNAscope, устоявшихся и широко используется иш пробирного системы. Обе системы анализа используют амплификации целевые технологии, которая увеличивает чувствительность обнаружения^11,12. Что отличает друг от друга — Длина последовательности целевых объектов, которая как 50 нуклеотиды для BaseScope и 300 – 1000 нуклеотидов для RNAscope коротким. Таким образом это возможно для дизайн зонды, выполняемых Экзон экзона развязок для выявления конкретных альтернативных мРНК изоформ. В текущем исследовании процедура была создана для изучения как выражение модели нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) экзона 23a, альтернативных экзона, широко учился в^13,же лаборатории,^14,,^{15 , 16 , 17}, в разделах мозга мыши. Результаты показывают, что BaseScope является идеальной системой для изучения моделей выражение Nf1 экзона 23a в situ. Как эта система анализа может быть адаптирована для анализа как выражение модели многих альтернативных экзонов, он представляет новый мощный инструмент в исследованиях AS.