Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Épissage alternatif (AS) est un processus commun qui se produit au cours de la maturation de l’ARN pré-messager. Dans ce processus, un exon peut figurer différemment dans l’ARNm mature. Ainsi, par le biais de AS, un gène peut générer plusieurs ARNm ce code pour produits protéiques différents. Il est estimé que 92 à 94 % des gènes humains subissent une variante épissage^1,2. Épissage des patrons d’anormale alternatif résulte de mutations génétiques ont été liées à un grand nombre de maladies, y compris la sclérose latérale amyotrophique, la dystrophie myotonique et cancer^3,4. Il est donc crucial d’enquêter et de mieux comprendre les mécanismes de régulation épissage alternatifs pour tenter de trouver de nouveaux traitements des maladies humaines.

COMME est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. Il est important de déterminer le modèle AS d’expression d’un gène spécifique dans un système biologique donné. Toutefois, cela se complique quand un organe complexe qui contient de nombreux types de cellules, comme le cerveau ou le cœur, est étudié. Dans ce cas, un choix idéal de système de dosage est RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de tissus des sections pour le modèle AS d’expression d’un gène spécifique peut être détecté dans de nombreux types de cellules en même temps. En effet, des sondes exon-spécifiques ont été utilisés pour évaluer le niveau d’expression d’un autre exon^5,6,7. Toutefois, cette approche n’est pas bien adaptée pour que l’analyse des habitudes pour les raisons suivantes. Tout d’abord, les classiques méthodes ISH utilisent généralement des sondes de plus de 300 bp, alors que la taille moyenne des vertébrés exons internes (pas premier ou le dernier exon) est 170 nucléotides^8,9. Deuxièmement, lorsqu’une sonde exon spécifique est utilisée pour examiner le modèle d’épissage d’un exon alternatif interne, l’isoforme d’ARNm uniquement détecté par la sonde est celle qui contient l’exon, tandis que l’isoforme ARNm sans l’exon ne peuvent pas être détecté. Ainsi, le calcul du pourcentage épissé en valeur (lb/po2) pour l’autre exon est compliqué. En outre, ISH fluorescent conventionnel combine souvent ISH immunomarquage, ce qui réduit l’efficacité de la détection et la robustesse. Par exemple, dans une étude qui a enquêté sur le stress induit par l’épissage isoforme de commutation de l’acétylcholinestérase (AChE) mRNA, digoxigénine fut incorporée à la sonde de l’ISH et détectés en utilisant des anticorps anti-digoxigénine. Par ailleurs, sonde marquée à la biotine a été détectée par un conjugué à la phosphatase alcaline/streptavidine et un substrat de la phosphatase alcaline¹⁰. Aucune méthode utilise toute stratégie d’amplification pour augmenter la sensibilité de détection. En conséquence, il est difficile de détecter des transcriptions d’ARNm qui sont expriment à de faibles niveaux. Ainsi, un système de dosage ISH plus simple et plus robuste est nécessaire pour analyser comme expression patterns in situ.

BaseScope a été récemment développé basé sur la plate-forme de RNAscope, un bien établi et largement utilisé le système d’essai ISH. Les deux systèmes de dosage emploient une technologie d’amplification spécifique à la cible qui augmente la sensibilité de détection^11,12. Ce qui distingue une de l’autre est la longueur de la séquence cible, qui est aussi courte que 50 nucléotides pour BaseScope et 300 – 1 000 nucléotides pour RNAscope. Ainsi, il est possible aux sondes de conception qui ciblent les jonctions exon-exon pour détecter des isoformes de mRNA alternatives spécifiques. Dans cette étude, une procédure a été créée pour examiner comme modèles d’expression de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) exon 23 a, un autre exon largement étudié dans le même laboratoire^{13,14,15 , 16 , 17}, dans les sections de cerveau de souris. Les résultats démontrent que le BaseScope est un système idéal pour étudier les profils d’expression de Nf1 exon 23 bis in situ. Comme ce système de dosage peut être adapté à analyser comme modèles d’expression de nombreuses alternatives exons, il représente un nouvel outil puissant dans les études d’As.